一种产生纤溶酶的链霉菌C-3662的鉴定及发酵研究

对一株从土壤中分离的纤溶酶产生菌链霉菌C - 3 6 6 2的形态、培养、生理生化和化学分类特征进行了研究 ,发现其与泛温链霉菌 (StreptomyceseurythermusCorbazetal.1 96 8)的特征很相符。通过对链霉菌C - 3 6 6 2的 1 6SrDNA序列进行测定与比对 ,发现它与泛温链霉菌的1 6SrDNA序列也有高达 98 1 9%的同源性。根据多相分类原则 ,认为链霉菌C - 3 6 6 2属于泛温链霉菌。对链霉菌C - 3 6 6 2的发酵培养基组成等的研究表明 ,合适的发酵培养基中应含有氮源黄豆饼粉 2 0 %、碳源淀粉 1 0 %和葡萄糖 2 5 %以及少量的无机盐类如硫酸镁。链霉菌C 3 6 6 2的发酵过程研究表明 。

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。

链霉菌C-3662产生的纤溶活性蛋白酶的纯化与理化性质

从链霉菌 C- 3662发酵上清液中 ,通过硫酸铵沉淀 ,CM- Sepharose Fast Flow和 Phenyl-Sepharose Fast Flow等层析色谱 ,分离纯化得到了具有纤溶活性的蛋白酶 CGW- 3,反向 HPLC鉴定纯度为 90 % ;每立升发酵上清液可得到 8mg纯品 ,活性回收率 46% ,CGW- 3为一单肽链蛋白 ,分子量 2 2 72 1 ,对丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF敏感 ,对 EDTA不敏感 ;其 N端 1 5个氨基酸的顺序为 VVGGTRAAQGEFPFM,与微生物来源的胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶有较高的同源性 . CGW- 3的等电点 p I9.0 ,纤溶活性的最适 p H为 7.5～ 8.0 ,对温度比较敏感 .CGW- 3不仅具有直接降解纤维蛋白作用 。

具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选(英文)

目的建立一种高通量筛选具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选方法。原理3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)是安莎类抗生素生物合成的前体。在通过氨基莽草酸途径生物合成AHBA的过程中,AHBA合酶是催化5-氨基-3-脱氢-5-脱氧莽草酸形成AHBA的一个特异性关键酶。AHBA合酶基因的存在可以作为放线菌菌株具有合成安莎类抗生素能力的一个必要而非充分的条件。AHBA合酶基因高度保守,通过PCR方法可以建立一种针对AHBA合酶基因存在与否的、具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌菌株高通量筛选方法。方法根据已知AHBA合酶序列的相似性,设计了针对AHBA合酶基因中高度保守的一段755bp片段大小的PCR筛选寡核苷酸引物,用于从土壤中分离的未知放线菌高通量筛选。结论从1900株土壤分离的未知放线菌中筛选获得33株AHBA合酶基因阳性菌株,即具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌菌株。

Streptomyces sp. 4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达。方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇。本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMDl8-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析。以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测。结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带。结论Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础。本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成。

脂肪酸生物合成—发现抗菌药物的靶位

耐药性致病菌的不断出现 ,迫切要求不断地开发新型抗菌药物。随着对细菌的基因组及酶学研究 ,发现细菌与哺乳动物的脂肪酸生物合成酶具有显著差异 ,可作为抗菌药物筛选靶位。目前已知的几个细菌脂肪酸生物合成酶抑制剂 ,除了异烟肼已作为抗结核病药物外 ,在临床上还没有得到应用。本文对细菌脂肪酸生物合成所涉及到的酶和蛋白质、已知的脂肪酸生物合成抑制剂及抑制剂的筛选研究进行了综述。

苯安莎类抗生素的一种早期鉴别方法

目的建立一种对苯安莎类抗生素特异的颜色反应早期鉴别方法。方法根据碱性处理苯安莎类抗生素,使其安莎链与苯环连接的酰胺键开裂后化合物呈紫色的原理,建立了将发酵液粗提品进行薄层色谱层析后采用2.0mol/L NaOH溶液喷涂显色的早期鉴别方法;以格尔德霉素为例,在硅胶板上的检测灵敏度为4μg。结论采用该颜色鉴别反应方法:1对两株确证为新的格尔德霉素产生菌Streptomyces sp.4-4以及Streptomyces sp.3-57进行了佐证;2对吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的一株格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株CT-1中产生的格尔德霉素前体物及其类似物,在硅胶板上进行了快速定位和初步鉴别。

新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120 s。每次辐射5 s后,冰上快速冷却20 s再照射,并将照射时间累计。以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率。结果表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60 s时致死率达到92.55%。微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50 s。初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%。最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticusNBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化。

西罗莫司产生菌Streptomyces hygroscopicus WY-93的诱变育种与代谢研究

研究了不同诱变方法对西罗莫司产生菌正变率的影响 ,发现紫外线单一因子处理、光复活较为有效 ;用这一条件处理得到一正变株 UV- 8- 6 1,其效价比出发菌株 Z2 7高 2～ 3倍 ,产生抗生素水平经连续传代证明非常稳定。本文还研究了菌落形态与发酵效价以及诱变后正变率与死亡率的关系 ,表明孢子丰富的梅花型或面包型菌株发酵效价较高。以紫外线单一因子、光复活处理死亡率在 99.90 %～ 99.95 %时正变率较高。另外 ,从代谢角度对高产株与原株对碳、氮源的利用及葡萄糖 - 6 -磷酸脱氢酶的活性进行了深入研究 ,发现两者在生长速度 ,碳、氮源的利用方面存在显著差别 ,尤其是高产株葡萄糖 - 6 -磷酸脱氢酶的活性明显高于原株。由此推断 ,高产株 UV- 8- 6 1西罗莫司产量的提高有可能是由于菌体生理代谢旺盛 ,参与戊糖一级代谢的 G- 6 -P脱氢酶活性提高 ,由此增加了作为西罗莫司生物合成环己烷前体的莽草酸的供给。

吸水链霉菌17997产生的4,5-双氢格尔德霉素的鉴别与检测

本文对从吸水链霉菌17997发酵提取获得的格尔德霉素精制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分。对吸水链霉菌17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累。已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量。本文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉素转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义。

AHBA合酶基因的筛选与放线菌素D产生菌的发现

根据3,5-AHBA合酶基因序列的保守性所设计的简并引物,通过PCR的方法,从20株未知产物放线菌菌株中,获得两个AHBA合酶基因阳性菌株(S.violaceusniger 4353和Streptomyces rochei 4088)。同源性分析显示,克隆到的3,5-AHBA合酶与已知的3,5-AHBA合酶蛋白序列有一定的同源性(86%～87%)。对其中一株阳性菌株4353(S.violaceusniger 4353)的发酵活性产物进行了化学分离纯化和TLC、HPLC-UV、MS、~1H-NMR和^(13)C-NMR等分析结构鉴定,表明其发酵产生的一个活性成分为放线菌素D。基因单交换阻断实验结果证明,4353菌株所产生的放线菌素D确实与3,5-AHBA合酶基因相关。本文对获得这一结果的可能原因进行了讨论。

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。

雷帕霉素发酵生物活性的测定方法

由吸水链霉菌 (Str.hygroscopicus) WY93- Z2 7中分离出具有抗真菌和免疫抑制活性的雷帕霉素 ,主要存在于菌丝内 ,少量分泌到细胞外。为适应大量菌种选育工作的需要 ,我们研究了 :(1)几种处理菌丝的方法 ,结果以 SDS裂解菌丝操作简便 ,省时 ,成本低 ;(2 )固体发酵与液体发酵法生物活性结果没有正相关关系 ;(3)一定条件下 ,液体发酵上清液效价可替代菌体效价用于初筛工作。

链霉菌Streptomyces sp. CPCC 200497次级代谢产物bohemamines的分离和鉴定

目的对醌霉素产生菌——Streptomyces sp.CPCC 200497产生的次级代谢产物进行深入研究。方法将Streptomyces sp.CPCC 200497进行固体发酵,用高效硅胶板薄层色谱、中低压制备色谱和高效液相色谱等方法对发酵培养物的乙酸乙酯提取物进行分析和纯化;通过质谱和NMR等对获得的单体化合物进行结构鉴定。结果从Streptomyces sp.CPCC 200497发酵物的乙酸乙酯提取物中发现了两个吡咯里西啶类生物碱,分别为bohemamine和bohemamine B。结论从醌霉素产生菌Streptomyces sp.CPCC 200497中首次分离得到bohemamine类化合物,并通过1D和2D-NMR对化合物的核磁数据进行了准确归属,为国内首次对该类化合物的分离鉴定进行报道。

基因组发掘策略指导铁载体类化合物的发现

目的利用基因组发掘策略指导铁载体类化合物的发现。方法首先,在获得灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)CPCC 200274全基因组序列的基础上,利用antiSMASH对其编码的潜在次级代谢产物生物合成基因簇进行生物信息学分析,通过Blastp比对,判断该菌株中是否存在铁阻遏蛋白(Dmd R1)同源基因,并借助于MEME、FIMO等软件寻找包含Dmd R1蛋白结合位点(iron box)的基因簇,则该基因簇可能为铁载体类化合物的生物合成基因簇;其次,摸索合适的发酵条件,利用实时定量RT-PCR(q RT-PCR)技术检测相关生物合成基因的表达水平;最后分离纯化目标铁载体类化合物,验证此基因组发掘策略的可行性。结果利用antiSMASH从灰产色链霉菌CPCC 200274基因组中发现了5个含有iucA_C基因、标注为铁载体的生物合成基因簇。Blastp比对提示该菌株基因组中存在Dmd R1的同源蛋白SGC5642,可能参与铁载体类化合物生物合成的调控。结合MEME、FIMO软件分析结果,5个含iucA_C的基因簇中只有cluster 29含有iron box序列,推测cluster 29可能编码铁载体类化合物。根据以上信息,利用q RT-PCR方法确定了该基因簇表达的发酵条件,分离纯化获得了3个铁载体类化合物,经结构鉴定分别为去铁敏B,去铁敏E和N1-羟基-N1-琥珀酰基尸胺。结论以基因组发掘策略为指导,从微生物基因组中发现铁载体类化合物生物合成基因簇和铁阻遏蛋白结合位点,并通过qRT-PCR方法在转录水平确定目标基因簇的方法,成功获得3个铁载体类化合物。该策略为解决目前antiSMASH对于铁载体类化合物生物合成基因簇预测的局限性和该类化合物基因簇的快速定位、新生物合成元件的发掘提供了新思路,为新结构铁载体类化合物的寻找及合成生物学改造奠定了基础。

榴菌素产生菌——链霉菌CPCC 200532中fogacin的分离鉴定

目的对Streptomyces sp.CPCC 200532产生的榴菌素类似物进行分离鉴定。方法 Streptomyces sp.CPCC 200532发酵培养物经乙酸乙酯萃取后,用硅胶板薄层色谱和高效液相色谱对萃取物进行分析;通过质谱和NMR等对榴菌素类似物进行结构鉴定。结果从Streptomyces sp.CPCC 200532中发现了一个榴菌素类似物,结构与fogacin一致。结论从榴菌素产生菌中首次分离得到化合物fogacin;与榴菌素A相比,fogacin显示微弱的抗枯草芽孢杆菌和白色念珠菌活性。

麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中的酰化特性

螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元大环内酯类抗生素,并且结构非常相似。螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C3上的一个取代基的差异,SPI组分为羟基、SPII组分羟基乙酰化、SPIII组分羟基丙酰化;麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素,麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基。已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成。本研究将螺旋霉素产生菌—Streptomyces spiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后,发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分,并且螺旋霉素III组分也不是主要组分,说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌—S.spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性,也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关。

链霉菌CPCC 203577产生的napyradiomycins的分离与鉴定

目的对一株具有抗菌活性的链霉菌CPCC 203577产生的次级代谢产物进行系统研究。方法采用ISP2琼脂平板发酵培养链霉菌CPCC 203577,乙酸乙酯提取发酵培养物,获得粗提物;粗提物经反相色谱柱、凝胶色谱柱、制备型TLC和半制备HPLC等分离纯化获得目标化合物纯品;MS和NMR等确定化合物结构;琼脂稀释法测定抗菌活性。结果从链霉菌CPCC 203577中分离鉴定了含萘醌并吡喃母核的3个已知化合物,3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α-lapachone(1)、16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2(2)和napyradiomycin A2(3)。化合物1具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性,最低抑菌浓度(MIC)值为4~8μg/ml;化合物2和3没有抗菌活性。结论链霉菌CPCC 203577具有丰富的次级代谢产物合成能力,产生napyradiomycins类化合物。