FOCUS-PDCA模式对ICU重症患者呼吸机相关性肺炎的影响

目的分析发现-组织领导-明确情况-分析了解-改进方案(find organize clarify understand select,FOCUS)-计划-执行-检查-行动(plan do check act,PDCA)模式对重症监护室(intensive care unit,ICU)重症患者呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)的影响。方法选取2022年10月—2023年9月菏泽市牡丹人民医院ICU接受机械通气治疗的重症患者120例,根据干预时间将其分为2组,即2022年10月—2023年3月60例患者作为对照组,2023年4—9月60例患者作为研究组。对照组接受常规干预措施预防VAP,研究组在此基础上,采用FOCUS-PDCA模式预防VAP。比较2组患者机械通气时间、住院时间、住院费用、一次性脱机成功率与VAP发生率。结果与对照组相比,研究组机械通气时间、住院时间更短(P<0.05),住院费用更低(P<0.05)。研究组一次性脱机成功率为96.67%,高于对照组的85.00%(χ^(2)=4.904,P<0.05);VAP发生率为1.67%,低于对照组的13.33%(χ^(2)=4.324,P<0.05)。结论FOCUS-PDCA模式能够有效降低ICU重症患者VAP的发生率,缩短机械通气时间与住院时间,节省住院费用,提高一次性脱机成功率,具有临床应用价值。

以循证为中心的精准护理在全膝关节置换患者围术期 中的应用

目的:探讨以循证为中心的精准护理在全膝关节置换患者围术期中的应用效果。方法:将2018年1月1日~2019年10月31日收治的96例TKA患者随机分为对照组和观察组各46例,对照组给予常规护理措施,观察组在对照组基础上开展以循证为中心的精准护理。比较两组美国特种外科医院(HSS)膝关节功能得分、并发症及护理满意度情况。结果:术后3个月,两组HSS评分中疼痛、功能、肌力、活动度、稳定性及屈曲畸形评分均高于术前(P<0.05),且观察组高于对照组(P<0.05);观察组深静脉血栓形成、肺栓塞、感染、关节肿胀、发热等并发症发生率低于对照组(P<0.05);观察组护理满意度高于对照组(P<0.05)。结论:将以循证为中心的精准护理应用于TKA患者,可改善其膝关节功能,降低并发症发生率,提高其满意度。

百草枯诱导多巴胺能神经元α-突触核蛋白的自噬性降解障碍机制

目的探讨百草枯(PQ)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)自噬水平的影响及诱导α-突触核蛋白(α-syn)异常聚集的机制.方法以SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元的体外模型,不同浓度PQ(0、18.75、37.5、75、150、300、600μmol/L)处理细胞24 h,150μmol/L PQ处理细胞不同时间(0、12、24、36、48、60、72、96 h),每组设5个复孔.CCK8法检测细胞相对存活率,确定剂量/时间-效应关系;不同浓度PQ(0、75、150、300、600μmol/L)处理细胞24h,150μmol/L PQ处理细胞不同时间,检测细胞LDH活力;蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞内自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)、自噬相关蛋白(Beclin1)、Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(Vps34)、泛素结合蛋白(p62)及α-syn表达水平;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测α-syn基因表达水平;免疫荧光法(Immunofluorescencetechnique,IF)检测α-syn表达水平;用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)100 nmol/L预处理细胞6h,Western blot检测处理前后细胞内自噬相关蛋白及α-syn的蛋白表达水平.结果PQ染毒细胞24h后,细胞相对存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).与正常对照组比较,PQ呈剂量依赖性和时间依赖性抑制SH-SY5Y细胞的增殖活性(P<0.05);与正常对照组比较,染毒组细胞上清中LDH活力明显升高(P<0.05);Western blot结果显示,与正常对照组比较,染毒组细胞内自噬相关蛋白比值(LC3II/LC3I)、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显下降(P<0.05),p62蛋白表达水平升高(P<0.05);细胞内α-syn蛋白和基因表达水平均明显升高(P<0.05);IF结果显示,经PQ处理后,细胞内α-syn荧光信号明显聚集于胞质,荧光强度增强(P<0.05);Western blot结果显示,与染毒组比较,RAPA干预组的LC3II/LC3I、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显升高(P<0.05),α-syn蛋白表达水平明显下降(P<0.05).结论PQ可能通过诱导SH-SY5Y细胞自噬功能障碍,引起细胞内α-syn的异常聚集.

低浓度百草枯诱导小鼠小胶质细胞异常活化的M1/M2表型变化

目的观察低浓度百草枯(PQ)对小鼠小胶质细胞(BV2)的激活情况,探讨PQ对BV2细胞M1/M2表型变化的影响。方法以BV2细胞为模型,用终浓度0、0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48μmol/L PQ及0.05μmol/L 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理细胞24 h,CCK8法测定细胞存活率;用终浓度0、0.015、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ及0.05μmol/L MPP+处理细胞24 h,酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量,Transwell小室法测定细胞迁移能力,免疫荧光法和流式细胞仪测定细胞吞噬能力;用终浓度0、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ及0.05μmol/L MPP+处理细胞24 h,蛋白免疫印迹(Western blot)法测定M1型BV2细胞标志物TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮合酶(iNOS)、CD86及M2型BV2细胞标志物Ⅰ型精氨酸酶(Arg-1)、甘露糖受体(CD206)的蛋白表达水平。结果与0μmol/L PQ组比较,0.03~0.12μmol/L PQ组BV2细胞增殖活性均明显升高,0.48μmol/L PQ组增殖活性明显抑制,差异均有统计学意义(P<0.05);0.03μmol/L PQ处理24 h的BV2细胞增殖活性明显升高(P<0.05);ELISA结果显示,与0μmol/L PQ组比较,0.03、0.06μmol/L PQ组BV2细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显升高(P<0.05);免疫荧光和流式细胞仪测定结果显示,与0μmol/L PQ组比较,0.015、0.03、0.06μmol/L PQ组细胞吞噬能力明显增强(P<0.05);Transwell结果显示,0.03、0.06、0.12μmol/L PQ组细胞侵袭能力较0μmol/L PQ组明显升高(P<0.05);Western blot结果显示,与0μmol/L PQ组比较,0.03、0.06μmol/L PQ组的M1型标志物TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和CD86蛋白表达水平明显升高,0.06、0.12μmol/L PQ组M2型标志物Arg-1、CD206蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论低浓度PQ可以异常激活BV2细胞,使得BV2细胞向促炎型M1型转化而抑制其向抗炎型M2型转化。

MAPK信号通路在百草枯诱导上皮-间充质改变中的作用

目的探讨MAPK家族中P38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c—Jun氨基端激酶（JNK）信号通路在百草枯（Paraquat，PQ）诱导的肺泡上皮细胞上皮．间质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中的作用。方法在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（RLE-6TN）中加入不同浓度PQ（0、25、50、100μmol／L）后共培养6、12、24ho倒置相差显微镜观察细胞形态学改变，划痕实验评估细胞迁移能力，免疫印迹法（Westernblot）检测上皮及间质细胞表型蛋白表达（上皮细胞表型蛋白：E—cad、ZO-1，间质细胞表型蛋白：Vimentin、a—SMA）、MAPK信号通路关键蛋白的表达（P-p38MAPK、P-Erkl／2、P-JNK），实时荧光定量PCR（RT—PCR）检测成纤维细胞，肌成纤维细胞（MFB／FB）主要产物COL-Ⅰ、COL—Ⅲ、Fn和EMT来源的成纤维细胞标志物FSP-1的基因表达。结果100μmol／LPQ分别处理6、12、24h，细胞由卵圆形或多边形的上皮细胞变成长梭形的间质细胞，细胞间连接消失，且时间越长形态学改变越明显。与对照组比较，50、100、200、300μmol／LPQ处理24h的细胞存活率明显下降，200μmol／LPQ作用于细胞的时间越长（6、12、24、36、48h），细胞存活率越低；与对照组比较，50、100μmol／LPQ诱导上皮细胞标记蛋白E-cad、ZO-1蛋白表达下调，且下调的趋势随时间延长更加明显，差异有统计学意义（P〈0．05）；同时，随着PQ诱导剂量的升高、时间的延长，间质细胞标记蛋白α-SMA、vimentin蛋白表达逐渐升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。划痕实验结果显示，与对照组比较，100μmol／LPQ处理24h后的细胞迁移能力明显增强，差异有统计学意义（P〈0．05）；与对照组比较，100μmol／LPQ诱导细胞24h后，P-p38MAPK、P-JNK及P-Erk1／2蛋白表达显著上调，差异有统计学意义（P〈0．05），分别给予上述蛋白的抑制剂进行干预后，蛋白磷酸化水平较诱导组均明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05）；RT-PCR结果显示，与对照组比较，PQ促进了Fn、COL-Ⅰ、COL—Ⅲ、FSP-1mRNA表达水平，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论PQ诱导肺泡上皮细胞通过EMT转变为间质细胞，可能为MFB的一个重要来源；MAPK家族中p38MAPK、ERK、JNK信号通路参与了PQ诱导EMT的发生。

AMPK-mTOK信号通路参与百草枯致PC12细胞的自噬抑制作用

目的探讨AMPK-mTOR信号转导通路在百草枯(paraquat,PQ)诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(PC12)自噬异常中的调控作用。方法用终浓度0、25、50、100、200、300、400 μmol/L PQ处理PC12细胞24 h,300 μmol/L PQ处理细胞不同时间(6、12、24、48 h),四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞相对存活率,确定剂量/时间-效应关系;终浓度0、100、200、300 μmol/L PQ处理细胞24 h,分光光度法检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力;二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)水平;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察自噬溶酶体的表达及分布变化;免疫荧光(IF)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平;免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62、Beclin1及AMPK-mTOR信号通路蛋白p-AMPK、p-mTOR表达水平。结果与对照组比较,100、200、300、400 μmol/L PQ染毒组的细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖关系,差异有统计学意义(P<0.05)。300 μmol/L PQ处理细胞不同时间(6、12、24、48 h),细胞存活率随染毒时间的延长而下降,其中12、24、48 h染毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,100、200、300 μmol/L PQ染毒组细胞上清液中LDH活力明显升高,细胞内ROS荧光强度明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);MDC染色结果显示,PQ染毒组的自噬溶酶体在核周分布密度降低、荧光强度减弱、自噬水平降低;免疫荧光结果显示,PQ染毒组的LC3荧光强度减弱,细胞自噬水平下降,与MDC染色结果一致。Western blot结果显示,与对照组比较,PQ染毒组的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达水平均明显降低,而p62蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。200、300 μmol/L PQ染毒组的p-AMPK蛋白表达水平降低,p-mTOR蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PQ致PC12细胞损伤过程中,细胞自噬水平降低,AMPK-mTOR信号通路发挥调节作用。

JNK/AP-1信号通路在百草枯诱导肺泡上皮细胞间充质转变中的作用

[目的]探讨c-jun氨基末端激酶(JNK)/转录因子激活蛋白-1(AP-1)信号通路在百草枯致大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞间发生上皮-间充质转变(EMT)中的作用。[方法]体外培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN,终浓度0、25、50、100、200、300、400μmol/L百草枯处理细胞24 h,终浓度200μmol/L百草枯分别处理细胞0、12、24、36、48、60、72 h,倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变;四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞相对存活率,确定剂量和时间-效应关系;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;免疫荧光、免疫印迹法(Western blot)分别检测上皮标志蛋白E-cad、ZO-1和间质标志蛋白FSP-1、α-SMA表达水平;Western blot检测JNK/p-JNK、c-jun/p-c-jun、c-fos/p-c-fos蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验检测AP-1的转录活性,评估百草枯对JNK信号通路的激活作用。[结果] 200μmol/L百草枯诱导细胞由卵圆形或多边形的上皮细胞变成长梭形的间质细胞,细胞间连接消失,且时间越长形态学改变越明显。与对照组相比,100、200、300、400μmol/L百草枯染毒组的细胞存活率明显降低(P <0.05),200μmol/L百草枯诱导细胞不同时间(24、36、48、60、72 h)的细胞存活率明显降低(P <0.05)。200μmol/L百草枯诱导细胞不同时间(12、24、36 h):细胞凋亡率随诱导时间的延长而增加,尤其36 h诱导组的细胞凋亡率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P <0.05);细胞迁移指数、侵袭细胞数均明显升高(P <0.05);上皮细胞标记蛋白E-cad、ZO-1表达下调,且下调的趋势随时间延长更加明显(P <0.05);间质细胞标记蛋白FSP-1、α-SMA表达随时间的延长逐渐升高(P <0.05);与对照组相比,100、200、300μmol/L百草枯染毒可诱导p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表达明显上调;200、300μmol/L百草枯染毒组较对照组比较,AP-1转录活性明显升高,差异有统计学意义(P <0.05)。[结论]百草枯呈剂量和时间依赖方式影响上皮细胞活性。百草枯能够诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT,JNK/AP-1信号通路可能参与了百草枯诱导肺泡上皮细胞EMT的发生。

百草枯通过DNA甲基化途径对人神经干细胞增殖的影响

目的观察百草枯(PQ)对人神经干细胞增殖的影响,探讨PQ基于DNA甲基化途径调控人神经干细胞增殖的作用机制.方法以永生化的人神经干细胞系(ReNcell CX)为体外模型,通过间接免疫荧光法检测巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,评估神经干细胞的自我更新和分化潜能;以终浓度0、5、25、50、100 μmol/L PQ作用细胞24h,以及50μmol/L PQ分别作用细胞6、12、24、48 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞存活率;应用终浓度0、25、50、100 μmol/L PQ处理细胞24 h,采用Sox2/Brdu、Nestin/Brdu免疫荧光双标记法检测神经干细胞的增殖能力;采用DNA甲基化定量试剂盒检测细胞总甲基化水平;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)的转录和表达变化.结果增殖期的干细胞能够大量表达Nestin蛋白,经诱导分化后,可获得表达相应特异性标志蛋白的神经元(β-tublin Ⅲ)和星形胶质细胞(GFAP);MTT显示,与对照组比较,PQ呈剂量依赖性和时间依赖性抑制ReNcell CX人神经干细胞的活力;免疫荧光双标记染色显示,Brdu和Sox2均呈双阳性表达,各个染毒组的Brdu+/Sox2+双标阳性率随PQ浓度增加逐渐降低(P<0.05);Brdu+/Nestin+双标阳性率也随PQ浓度增加而逐渐降低,其中50、100 μmol/L染毒组的双标阳性率较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);DNA总甲基化水平检测结果显示,与对照组比较,25、50、100 μmol/L PQ染毒组细胞的总甲基化水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组比较,50、100 μmol/L PQ染毒组的Dnmt1、Dnmt3a蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);50、100 μmol/L染毒组的Dnmt3b蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,与对照组比较,25、50、100 μmol/L PQ染毒组的Dnmt1、Dnmt3a基因表达水平降低,50、100 μmol/L PQ染毒组Dnmt3b基因表达水平明显升高(P<0.05).结论 25、50和100 μmol/L PQ可能通过降低DNA甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a)的蛋白表达和转录水平,抑制DNA甲基化反应的发生,进而抑制人神经干细胞的增殖.