3株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定、VP1基因遗传进化分析及致病性评价

为了解国内鸡场鸡传染性贫血(CIA)的流行状况和鸡传染性贫血病毒(CIAV)的遗传变异规律,以期对CIA的传播流行和预警防控提供技术支持。本试验对2020年在3个省份疑似发生CIA的3个规模鸡场采集10份组织脏器样品,应用鸡胚进行病毒的分离培养,并对培养物进行CIAV PCR检测,进而对CIAV阳性样本进行VP 1基因扩增和测序,应用Lasergene和MEGA 6.0软件,对获得的所有分离毒株结构蛋白VP 1基因序列与GenBank中CIAV参考毒株进行比对,构建系统发育进化树,同时对分离的CIAV毒株进行动物回归试验,评价其对鸡的致病性。结果显示,10份样品中3份为CIAV阳性,共分离到3株CIAV,分别命名为202006-NX-4-2、202006-SD-2-1和202006-JX-016。VP 1基因相似性分析显示,3株CIAV分离株核苷酸相似性介于97.7%~99.6%,且均与国内分离株具有较高同源性;氨基酸序列分析显示,3株CIAV分离株毒力相关位点均与国内强毒株GD-101株一致。遗传进化分析结果显示,3株分离株属于同一进化分支(Ⅱ分支),202006-SD-2-1株和202006-JX-016株与JL15120株进化关系最近,202006-NX-4-2株则与以国内强毒株GD-101株为代表的其他Ⅱ分支参考株进化关系最近。动物回归试验结果显示,3株CIAV均能够引起1日龄鸡发生严重的淋巴器官萎缩、骨髓黄化,为典型的高致病性病毒株特征。本试验结果为当前国内CIAV的流行、毒株的遗传变异分析及相关疫苗研发提供了参考依据。

Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫效果研究

为评价Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2重组蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果,本研究利用FAV-HN株Fiber-2基因构建pET-30a-Fiber-2重组质粒,转化至BL21感受态诱导表达Fiber-2重组蛋白;Fiber-2蛋白纯化后制备不同抗原含量的亚单位疫苗,免疫SPF鸡进行免疫效力评价。结果表明,Fiber-2蛋白部分为可溶性表达,纯化后纯度约90%,AGP效价达1∶64。亚单位疫苗抗原含量AGP效价不低于1∶2时,SPF鸡免疫后第21 d AGP抗体10/10阳性,可抵抗Ⅰ群禽腺病毒(4型)强毒株的攻击,提供100%的免疫攻毒保护。

新佐剂新流二联浓缩苗与常规新流二联苗肉鸡免疫效果比较

为比较新型油佐剂鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联浓缩灭活疫苗(以下简称“新佐剂新流二联浓缩苗”)与常规油佐剂鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(以下简称“常规新流二联苗”)在商品肉鸡上的免疫效果,本研究用7日龄AA肉鸡对两种疫苗的安全性和有效性进行评价。安全性评价结果表明,商品肉鸡免疫新佐剂新流二联浓缩苗和常规新流二联苗后无任何不良反应,两种疫苗对肉鸡生长无影响,但新佐剂新流二联浓缩苗使用剂量免疫后14 d疫苗即可完全吸收,而常规新流二联苗免疫后28 d疫苗才能完全吸收。效力评价结果表明,与常规新流二联苗相比,新佐剂新流二联浓缩苗免疫后抗体产生速度快、滴度高、均匀度好,免疫后7 d即可为免疫鸡提供针对NDV和H9亚型禽流感的完全攻毒保护,保护效果优于常规新流二联苗。研究结果显示,新佐剂新流二联浓缩苗在肉鸡上安全、有效,具有疫苗粘度低、免疫剂量小、抗体产生快、疫苗吸收快的优势,适合大范围应用于肉鸡。

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒。结果显示,免疫后21 d,HF株灭活疫苗免疫组HI抗体效价达到9.1 log2以上,商品化疫苗HI抗体效价几何平均值则为6.3 log2以内。4株H9亚型禽流感病毒流行毒株以10^(7.0)EID_(50)的剂量静脉攻毒后,HF株灭活疫苗免疫组可抵抗流行毒株的攻击,保护率为100%;而商品化疫苗对流行毒株的攻毒保护率仅为40%~60%。说明H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗具有较强的免疫原性,能使免疫鸡抵抗流行毒株的攻击。

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的安全性和有效性

为研究鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(N7a株+M41株+SZ株)(以下简称"三联苗")的应用效果,使用14日龄AA肉鸡和210日龄蛋鸡进行安全性和有效性研究。安全性研究结果表明,三联苗免疫肉鸡后鸡群精神、采食等状况无任何异常,注射部位无溃烂、肿胀、发炎等症状,各时间点体质量与对照组无明显差异,出栏当日疫苗完全吸收;三联苗免疫蛋鸡后鸡群无任何不良反应,产蛋率与对照组无明显差异。有效性研究中,肉鸡免疫后抗体HI效价持续升高,出栏当日NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价达到高峰,分别为8.8 log2、6.7 log2、9.3 log2;攻毒保护结果表明,免疫后21 d,三联苗能对新城疫和禽流感(H9亚型)提供完全保护。蛋鸡免疫后21 d NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价达到最高,分别为11.6 log2,8.9 log2,12.1 log2,而后逐渐降低,但免疫后6个月仍然保持在较高的水平。本研究表明,三联苗免疫肉鸡和蛋鸡安全、有效。

C种禽腺病毒血清4型FAV-HN株的分离鉴定及致病性试验

对河南某疑似禽腺病毒发病鸡场采集的组织病料进行PCR鉴定,并通过病毒分离培养、遗传进化分析及动物致病性试验等对其进一步验证,最终分离得到1株C种血清4型禽腺病毒,命名为FAV-HN株。组织病料经研磨处理后,经PCR扩增得到与预期大小一致的Hexon基因片段;通过电镜观察,FAV-HN株具备腺病毒典型的形态特征;将FAN-HN分离株与NCBI数据库中C种血清4型禽腺病毒的序列进行同源性比对及遗传进化分析,结果发现该分离毒株与其他血清4型参考毒株Hexon基因的核苷酸同源性为99%,且属于同一分支。将FAV-HN分离株以不同剂量接种至SPF鸡,SPF鸡表现出心包积液、肝炎等特征性病变,且每只107.0TCID50的感染剂量可使SPF鸡100%死亡。本研究为C种禽腺病毒血清4型的疫苗及诊断试剂的研发奠定了基础。

禽腺病毒(C种,4型)精制卵黄抗体研制及免疫效果评价

为了评价以禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备精制卵黄抗体的免疫效果,本研究使用重组大肠杆菌BL21(DE3)-Fiber-2株诱导表达禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白,蛋白纯化后制备免疫原,免疫产蛋鸡收获高免蛋,经提纯获得的精制卵黄抗体AGP效价达1∶8;将精制卵黄抗体注射SPF鸡进行免疫效果评价。结果表明,精制卵黄抗体经肌肉或皮下注射SPF鸡,注射后7d内可100%保护鸡群抵抗禽腺病毒(C种,4型)强毒株的攻击,另外强毒株人工感染后24 h内肌肉或皮下注射抗体1.0 mL/只,可为感染鸡提供90%~100%的保护。本研究表明,以原核表达制备的禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备的精制卵黄抗体免疫效果较为理想,为后续抗体的临床应用提供了技术参考,并为该病的防控提供了新的思路。