三七总皂苷通过p38 MAPK通路抑制内毒素诱导的小胶质细胞活化

目的:探讨三七总皂苷(PNS)通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路对脂多糖(LPS)诱导活化的BV2小胶质细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法:将BV2小胶质细胞分为空白对照组(Control)、LPS激活组和LPS+三七总皂苷干预组(LPS+PNS)。CCK-8法检测BV2小胶质细胞的活力,确定最适合的药物干预浓度。利用Western Blot和免疫荧光检测BV2小胶质细胞中p38 MAPK和TNF-α的表达及p38 MAPK磷酸化水平(p-p38 MAPK)变化。结果:与空白对照组相比,PNS对BV2小胶质细胞的细胞活力无显著差异,最终选定100 mg/L作为药物干预浓度。Western Blot、免疫荧光结果提示,LPS激活后,BV2小胶质细胞中TNF-α的表达显著升高,p38 MAPK磷酸化水平增加(P<0.05);PNS干预后,与LPS激活组相比,TNF-α表达显著下降,p38 MAPK磷酸化水平降低(P<0.05)。使用p38 MAPK通路抑制剂(SB203580)作用后,PNS联合SB203580组(LPS+PNS+SB203580)中,TNF-α表达及p38 MAPK磷酸化水平变化与LPS+PNS组相比无显著差异(P>0.05)。此外,p38 MAPK在各组的变化无显著性差异(P>0.05)。结论:PNS可能通过p38 MAPK通路抑制活化的BV2小胶质细胞分泌的炎性因子TNF-α的表达。

灯盏乙素通过环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症

目的探讨灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症的影响。方法培养BV-2小胶质细胞系,将BV-2小胶质细胞分为对照组(Ctrl)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)抑制剂RU320521(RU.521)组、LPS组、LPS+RU.521组、LPS+灯盏乙素预处理(LPS+S)组、LPS+S+RU.521组,共6组。Western blotting及免疫荧光双标染色法检测并观察BV-2小胶质细胞中cGAS、干扰素基因刺激因子(STING)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、PYD结构域蛋白3(NLRP3)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化(n=3)。结果Western blotting和免疫荧光双标染色均显示,与对照组相比,LPS诱导后,BV-2小胶质细胞中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+S组中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。使用cGAS通路抑制剂RU.521后显示了与灯盏乙素预处理组相似的作用效果。此外,NF-κB在各组的变化不明显(P>0.05)。结论灯盏乙素干预抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应,可能与cGAS-STING信号通路有关。

天麻素经PI3K/AKT通路改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后小胶质细胞介导的炎症反应

目的探讨天麻素通过PI3K/AKT信号通路对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后活化小胶质细胞介导的炎症反应的作用机制。方法将39只3日龄新生SD大鼠随机分为假手术组(sham,n=9)、缺氧缺血模型组(HIBD,n=15)、天麻素处理组(HIBD+G,n=15)。采用Western blotting检测HIBD后TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β1蛋白的表达;网络药理学筛选天麻素治疗HIBD的潜在作用靶点;Western blotting检测HIBD和氧糖剥夺(OGD)诱导活化的小胶质细胞中PI3K/AKT信号通路的表达;CCK8检测PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002对BV-2小胶质细胞的细胞毒性作用;RT-qPCR检测LY294002干预后天麻素对TNF-α和TGF-β1的mRNA水平的影响。结果Western blotting显示,与HIBD组相比,天麻素降低缺血侧胼胝体区TNF-α和IL-1β的蛋白表达(P<0.05),促进IL-10和TGF-β1的蛋白表达(P<0.05);网络药理学显示,PI3K/AKT信号通路显著富集,且天麻素与PI3K之间具有较好的结合能力;Western blotting显示,与HIBD组、OGD组相比,天麻素促进PI3K和AKT的磷酸化水平(P<0.05);CCK8结果显示LY294002在0~120μmol/L浓度范围内对BV-2小胶质细胞没有细胞毒性作用;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,OGD组TNF-α的mRNA水平升高,TGF-β1的mRNA水平降低(P<0.05);天麻素干预后降低TNF-α的mRNA水平,升高TGF-β1的mRNA水平(P<0.05);LY294002处理后TNF-α的mRNA水平进一步升高,TGF-β1的mRNA水平进一步降低(P<0.05);而LY294002与天麻素联合用药后TNF-α和TGF-β1的mRNA水平无明显变化。结论天麻素能抑制HIBD后活化小胶质细胞介导的炎症反应,其作用机制与PI3K/AKT信号通路有关。

灯盏乙素对脑缺血大鼠小胶质细胞SIRT1/NF-κB通路的影响

目的:探究灯盏乙素干预大鼠脑缺血小胶质细胞(MG)中沉默信息调节因子2相关酶1/核因子κB(SIRT1/NF-κB)信号通路的表达变化。方法:雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、大脑中动脉闭塞组(MCAO组)、MCAO+灯盏乙素干预组(MCAO+S组)。Western Blot和免疫荧光染色检测大鼠脑缺血皮质区SIRT1、NF-κB(p65)的表达变化和NF-κB磷酸化水平(p-p65)。结果:Western Blot和免疫荧光染色结果显示灯盏乙素干预显著促进大鼠脑缺血后缺血皮质区SIRT1的表达,显著降低NF-κB的磷酸化水平(P<0.05)。结论:灯盏乙素对脑缺血大鼠小胶质细胞SIRT1/NF-κB信号通路具有调控作用。

灯盏乙素对激活的小胶质细胞中PI3K表达和磷酸化水平的影响

目的:探究灯盏乙素对激活的小胶质细胞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化PI3K(p-PI3K)水平的影响。方法:用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)法制备脑缺血模型,大鼠随机分成假手术组(Sham)、脑缺血组(MCAO)、脑缺血+灯盏乙素组(MCAO+S)。利用糖氧剥夺(OGD)法制备BV2小胶质细胞缺血缺氧损伤模型,随机分成对照组(Control)、OGD组、OGD+灯盏乙素组(OGD+S)。运用免疫荧光双标染色和Western Blot法检测不同组中小胶质细胞PI3K及PI3K磷酸化水平的变化。结果:体内和体外免疫荧光及Western Blot结果均显示,激活的小胶质细胞中PI3K磷酸化水平明显增加(P<0.05),灯盏乙素干预后PI3K磷酸化水平进一步升高(P<0.05);PI3K在各组间无明显变化(P>0.05)。结论:灯盏乙素可能通过上调激活的小胶质细胞中PI3K的磷酸化水平,对脑缺血发挥积极的治疗作用。

大麻二酚对多重脑震荡大鼠NLRP3炎性小体表达的影响

目的:探究大麻二酚(CBD)对多重脑震荡(MCC)大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体表达的影响。方法:制备大鼠多重脑震荡模型,分为Sham组、MCC组、溶剂组(MCC+TW)、CBD-L组(10 mg/kg)及CBD-H组(40 mg/kg)。应用免疫荧光双标染色法观测脑内NLRP3与小胶质细胞的变化,并用Western Blot检测NLRP3炎性小体的表达变化。结果:免疫荧光双标染色显示,MCC后皮质区大量lectin阳性小胶质细胞激活,胞体增大,小胶质细胞中NLRP3的免疫荧光强度明显升高(P<0.05);给予CBD可下调激活的小胶质细胞内NLRP3的表达,且CBD-H组较CBD-L组效果更明显(P<0.05)。Western Blot显示,大鼠MCC后皮质、海马及基底节中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达水平显著升高(P<0.05),且皮质区升高最明显;CBD-L组和CBD-H组中上述蛋白表达下降(P<0.05)。结论:大麻二酚可抑制多重脑震荡大鼠脑内NLRP3炎性小体表达,发挥抗炎保护作用。

依达拉奉经MAPKs通路对脂多糖激活的小胶质细胞Sirt3表达调控

目的探究依达拉奉对LPS激活的小胶质细胞Sirt3和MAPKs通路相关蛋白的作用及其调控机制。方法采用Western blot和免疫荧光双标染色检测LPS激活的BV2小胶质细胞中Sirt3和MAPKs通路相关蛋白ERK1/2、P38、JNK及p-ERK1/2、p-P38和p-JNK的表达;检测ERK1/2通路抑制剂处理后p-ERK1/2和Sirt3的表达。结果LPS激活的BV细胞中Sirt3、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK表达显著增高,依达拉奉能促进Sirt3和p-ERK1/2过表达,并降低p-P38和p-JNK表达;ERK1/2抑制后p-ERK1/2和Sirt3的蛋白表达降低。依达拉奉可促进激活的BV2细胞中Sirt3和p-ERK1/2过表达,并下调过表达的pP38和p-JNK。结论依达拉奉可调节BV2细胞中MAPKs信号通路并促进Sirt3生成,可能经ERK/Sirt3通路发挥抗炎作用。

灯盏乙素对大鼠脑缺血后小胶质细胞cGAS/STING/NLRP3信号轴的调控

目的:探讨灯盏乙素对大鼠脑缺血后小胶质细胞环状GMP-AMP合成酶(cGAS)/干扰素基因刺激蛋白(STING)轴及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达的影响。方法:将36只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham)、大脑中动脉栓塞(MCAO)、MCAO+灯盏乙素干预组(MCAO+S)。开颅法制备大鼠脑缺血模型,分别用HE染色观察大鼠脑组织病理性变化,免疫荧光染色检测大鼠小胶质细胞中cGAS、STING、NLRP3表达的变化,Western Blot检测大鼠缺血后3 d脑内cGAS、STING、NLRP3蛋白表达的变化。结果:HE染色显示,灯盏乙素干预后,缺血区皮质中神经细胞数量减少、分布紊乱、细胞间隙大等病理现象较MCAO组明显改善;免疫荧光染色显示MCAO+S组中小胶质细胞的激活受到抑制,cGAS、STING、NLRP3在小胶质细胞中的表达水平下降;Western Blot结果显示,MCAO组中cGAS、STING、NLRP3表达显著增加,灯盏乙素干预后,上述指标明显下降。结论:灯盏乙素可抑制大鼠脑缺血后小胶质细胞中cGAS/STING/NLPR3的过表达,减轻小胶质细胞介导的神经炎症。

基于网络药理学及分子对接探讨灯盏细辛治疗缺血性脑卒中的作用机制

目的:通过网络药理-分子对接探讨灯盏细辛防治缺血性脑卒中的潜在分子作用机制。方法:通过中草药系统药理平台(TCMSP)数据库筛选灯盏细辛的活性成分及潜在作用靶点;通过在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、生物信息学和化学信息学数据库(DrugBank)、人类基因综合数据库(GeneCards)检索缺血性脑卒中相关靶点。蛋白质数据库(Uniprot)对靶点标准去重,导入韦恩(Venny)在线平台,得到两者交集靶点。通过基因间功能关联数据库(STRING)和Cytoscape 3.7.1软件对交集靶点进行蛋白相互作用(PPI)可视化分析;接着对交集靶点进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。AutoDock Vina1.5.6软件对关键活性成分与核心靶点进行分子对接验证并实现对接结果的可视化。结果:获取灯盏细辛11个有效成分及176个作用靶点;缺血性脑卒中相关靶点690个,二者的交集靶点69个。通过PPI网络可视化分析,根据度值大小筛选出肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等10个核心基因。KEGG富集到高级糖基化终末产物-受体(AGE-RAGE)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。根据度值大小选取排名前三的有效活性成分及排名前五的靶蛋白,分子对接结果显示之间具有较好的结合能力。结论:灯盏细辛治疗缺血性脑卒中可能通过有效成分槲皮素、山奈酚、木犀草素,作用IL-6、IL-1β、TNF、VEGFA、AKT1等多靶点,通过IL-17、TNF等多条信号通路发挥作用,有着多成分、多靶点、多通路的特点。

依达拉奉对脂多糖激活的小胶质细胞向M2型极化的影响

目的:探究依达拉奉对脂多糖(LPS)激活的小胶质细胞(MG)向M2型极化的影响。方法:利用脂多糖(LPS)激活体外培养的BV2小胶质细胞,复制小胶质细胞激活模型,分为对照组(control)、模型组(LPS)和LPS+依达拉奉组(LPS+E,100μmol/L),通过Western Blot和荧光双标染色技术,检测M2型小胶质细胞标记物:几丁质酶样蛋白1/2(YM1/2)、精氨酸酶⁃1(Arg⁃1)、白介素10(IL⁃10)和甘露糖受体(CD206)的表达变化。结果:Western Blot和免疫荧光双标染色均提示:LPS组中YM1/2、Arg⁃1、IL⁃10和CD206的表达升高,与control组相比差异具有显著性(P<0.05),依达拉奉干预后,M2型小胶质细胞标记物表达进一步增高,LPS+E组与LPS组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:依达拉奉可促进LPS激活的小胶质细胞向M2型极化,发挥抗炎作用。