产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程。[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价。[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失。突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约103倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击。实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力。[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。

微生物生物学研究型教学改革初探

本文就微生物生物学课程体系建设、授课方法、教学手段以及实验教学模式等方面进行探索。通过教学实践证明,改革微生物生物学教学模式能激发学生的学习兴趣,培养学生的独立解决问题的能力,发展他们的创造性思维,是培养高素质创造型人才的重要途径。

单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用

以猪霍乱沙门氏菌作为包被抗原 ,利用沙门氏菌O7单克隆抗体酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪霍乱沙门氏菌抗体。经过研究确定抗原包被浓度为 2×1 0 8CFU/ml,血清检测稀释度为 1∶1 6,酶标抗体浓度为 1∶70 0 ,包被液为碳酸盐缓冲液 ( 0 .0 5MpH9.6)。应用单抗竞争ELISA和平板凝集试验 (PAT)同时对 5 0 6份血清进行猪霍乱抗体检测 ,PAT的检出率为 3 .60 % ,ELISA检出率为 5 .75 % ,两者符合率达 96.4%。试验结果表明 ,ELISA方法敏感性高 ,特异性强 ,稳定性和重复性好 ,操作简便。本方法的建立在猪群沙门氏菌感染的检疫、实验室诊断的标准化及流行病学调查方面具有应用价值。

李斯特菌溶血素基因的原核表达及其生物学特性

李斯特菌溶血素 (LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子 ,利用PCR技术从血清型 4b的产单核细胞李斯特菌菌株中扩增出编码LLO的hly基因 ,经克隆筛选和测序鉴定后 ,构建成该基因的原核表达质粒pGEX6P 1 hly,SDS PAGE结果表明 :LLO与谷胱甘肽在大肠杆菌中已融合表达 ,融合蛋白的分子量为 82kD ;溶血实验证明融合蛋白具有较强的裂解真核细胞膜的作用 ,表明表达产物LLO具有生物活性 ,其溶血效价达 2 2 6× 10 4 HU mg ,这为进一步研究其致病与免疫机理。

产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

利用PCR技术从血清型1／2a的产单核细胞李斯特菌Lm-4株中扩增出actA基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA，转入E．coli后，IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果表明，actA基因在两种载体中均获得表达，融合蛋白的大小分别约为120kDa和97kDa。以纯化蛋白为材料进行了AetA单抗的研制，获得4株抗ActA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹水单抗ELISA效价为1：5×10^4-1：1×10^5。选取单抗1A5进行Western blot分析，结果表明单抗1A5能和表达产物进行特异性反应，且与Lm-4多抗血清的Western blot结果一致。actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础。

微生物共发酵提高三七糠饲用价值的研究

对白地霉Ｙ９６１０１株、绿色木霉Ｙ９６３０１株、米曲霉Ｌ９６２０１株和产朊假丝酵母Ｐ９６４０１株混合发酵三七糠生产的单细胞蛋白（ＳＣＰ）产品的饲用价值进行了研究。混菌发酵三七糠ＳＣＰ的纯蛋白质含量比发酵前提高１３０％，纤维素比发酵前降低３０．７％、小鼠急性毒性试验和微核试验均证明该产品无毒性。鹅的饲养试验表明：三七糠ＳＣＰ产品适口性好、能降低料肉比、促进生长，具有潜在的应用前景。

产单核细胞李氏杆菌突变株的感染动力学研究

以BALB/c小鼠为实验动物模型,对actA基因和plcB基因双缺失的产单核细胞李氏杆菌(LM)yzuLM1-2菌株进行感染动力学研究。分别用减毒突变株yzuLM1-2和野生型菌株yzuLM4给BALB/c小鼠静脉注射或灌服,并对脏器中LM的分布动态进行测定。结果显示,在显著高于野生型菌株感染剂量的条件下注射或灌服接种后,减毒突变株组小鼠肝和脾中的LM数量迅速下降,被清除的速度显著快于野生型菌株组。溶血素(LLO)抗体的测定结果显示,减毒突变株菌能和野生型菌同样激发较高水平的抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,减毒突变株免疫组对同种血清型LM的攻击具有较好的免疫保护力,可达100%。结果表明,yzuLM1-2突变株侵袭力下降,致病力降低,能激发较高水平的抗体产生,可以作为预防动物李氏杆菌病的候选疫苗菌株,并为用作运送外源保护性抗原的载体提供了材料。

耐盐基因HAL1的克隆及植物表达载体的构建

对编码调节离子转运蛋白的基因HAL1进行克隆、序列测定,并对植物表达载体进行构建。基因测序分析表明:该基因含有885个核苷酸,与GenBank上公布的HAL1基因的核苷酸同源性为99.30%,氨基酸序列同源性为99.32%。利用Hind 和Xba 切点插入质粒pBY505的Actin启动子与PIN终止子之间,构建成适宜于直接转化法转化植物的表达载体pBHAL1。

TWEAK在心肌梗死后大鼠心肌组织中表达特点的研究

目的探讨心肌梗死后大鼠心肌组织中肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(TWEAK)的表达。方法 72只雄性SD大鼠随机分成两组:心肌梗死组和假手术组。心肌梗死组采用结扎冠状动脉左前降支(LAD)方法构建大鼠心肌梗死模型。假手术组仅开胸,不结扎冠状动脉。两组大鼠再随机分成24 h、2周、4周、8周共4个亚组。记录两组大鼠术前及术后2周心率、体重变化。应用超声心动图仪测定术前及术后2周大鼠左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD),计算左室短缩分数(LVFS)、左室射血分数(LVEF)。Western Blot(WB)检测心肌组织TWEAK蛋白表达情况。结果与假手术组相比,心肌梗死2周后大鼠心率加快(P<0.01),大鼠心室前壁运动减弱,LVEDD、LVESD扩大,LVEF、LVFS显著降低(P<0.01)。心肌梗死后24 h、2周、4周及8周大鼠心肌组织TWEAK蛋白表达均明显增加(P<0.01),至8周时已出现下降趋势。2周时大鼠心肌组织中TWEAK表达量与LVEDD、LVESD呈正相关,与LVEF、LVFS呈负相关(P<0.01)。结论心肌梗死大鼠心肌组织的TWEAK表达增高,并随着梗死后时间推移而逐渐升高,至8周时出现下降趋势。心肌梗死2周后大鼠心室腔扩大,心脏收缩功能降低,与心肌组织中TWEAK的表达存在相关性,提示TWEAK可能参与心肌梗死后心室重构过程。

产单核细胞李斯特菌减毒候选菌株分子生物学特性研究

目的为了确定用于减毒的产单核细胞李斯特菌菌株,对初筛入选的血清型为1/2a菌株Lm1、Lm2、Lm3和Lm4的分子生物学特性进行了比较研究。方法利用PCR技术均成功地扩增出4株菌株的hly基因及actA和plcB基因片段。以LD50的测定试验作为菌株毒力指征,对4株菌株的毒力进行了测定。结果4株菌株均为强毒菌株,其中菌株Lm4的毒力最强,用BALB/c小鼠测得的LD50为1.47×104CFU。结论确定以Lm4作为候选菌株。

表达绿色荧光蛋白的单核细胞增生李斯特菌重组菌株的构建及其生物学特性

目的为了对单核细胞增生李斯特菌运送外源抗原所诱导免疫应答特性进行评价,开展了以原核方式运送模式蛋白GFP的研究。方法利用SOEing PCR的方法把LLO的启动子与GFP融合在一起,通过同源重组的方式整合到yzuLM1-2actA和plcB基因片段之后,在LLO启动子的作用下实现GFP的表达。结果PCR扩增证实目的基因gfp融合到李斯特菌基基因组中,重组菌对小鼠的LD50为4.31×108,毒力比yzuLM1-2显著降低。以重组菌株免疫小鼠后获得的血清进行Western blot显示在27kD处出现特异印迹带;ELISA测定结果显示能诱导小鼠产生较高的抗GFP的抗体水平。结论研究结果表明减毒LM所运送的GFP能诱导小鼠产生较强的免疫应答的特性,这为减毒株yzuLM1-2运送外源保护性抗原的研究奠定了基础,也为开展减毒重组菌与抗原递呈细胞之间的相互作用及其诱导的免疫应答分析提供了必要条件。

混菌同步发酵三七糠关键参数的测定

绿色木霉（Ｙ９６３０１）、米曲霉（Ｌ９６２０１）、白地霉（Ｙ９６１０１）、产朊假丝酵母（Ｐ９６４０１）的生物学特性研究表明，Ｙ９６３０１在产酶培养基上具有较高的纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ、ＦＰａｓｅ、βＧａｓｅ）活性，其中ＣＭＣ酶活力可达到４５１１ＩＵ，ＦＰ酶活力可达到１０４９ＩＵ，纤维素降解率为２６．９％。在三七糠培养基进行混菌发酵试验表明，Ｌ９６２０１、Ｙ９６１０１、Ｐ９６４０１是Ｙ９６３０１的最佳配伍菌株。在３０℃、ｐＨ６的条件下，培养２８ｈ可使产品纯蛋白含量达到２２．１３％，纤维素降解率为３０．７％。该发酵产品经喂猪初步试用，适口性好，可部分替代动物蛋白和植物蛋白。

微生物生物学课程群新体系促进“三创”人才培养

针对新时期生物类人才培养的要求,将与微生物学相关的课程进行优化整合,搭建起一个理工交融、学科交叉、产学研结合的微生物生物学课程群新体系。探索并实践研究型课堂教学,搭建和实践创新型实验教学,改革考评体系,构建了不断提高学生创新能力的研究型教学新模式。实施产学研结合,形成以科研带教学、教学促科研的良性循环,在＂三创＂人才培养方面取得了显著成效。

微生物生物学教学改革探析

在微生物生物学教学过程中对理论课,实验课研究性教学及双语教学进行了探索,在研究性教学中充分调动了学生的积极性,达到了在“在研究中学习、在学习中研究”的目的；实验课教学自由选题、自主设计和实施实验方案的教学方式,大大提高独立思考问题解决问题的能力,提高了学生实践能力.双语教学明显提高了学生的综合素质.

急性心肌梗死早期血脂分析

目的:探讨急性心肌梗死患者早期血脂特点。方法:将311例行冠脉造影的患者根据病史、实验室检查及冠脉造影结果分为冠脉正常组、非急性心肌梗死冠心病组、急性心肌梗死组,分析各组的TC、HDL-C、LDL-C水平并进行对比。结果:急性心梗组早期TC、LDL-C均较冠脉正常组高,TC的差异有统计学异常,TC、LDL-C较非急性心梗组低,且LDL-C的差异有显著性;非急性心梗组TC、LDL-C均较冠脉正常组高,差异有显著性。HDL-C在急性心梗组最低,与冠脉正常组及非急性心梗组相比,差异均有显著性。结论:急性心肌梗死早期HDL-C即有明显下降,TC、LDL-C则升高不显著,且有下降趋势,因此不能以急性心肌梗死早期的血脂水平来决定临床的降脂治疗。

携带新城疫病毒DNA疫苗的鼠伤寒沙门氏菌及其安全性与免疫效力

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1F。将pVAX1F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1F)。重组菌以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,细菌对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将SL7207(pVAX1F)分别以108CFU和109CFU的剂量3次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,抗体检测结果显示,在三免后1周,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体,并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的保护率为77.27%,与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。

应用PCR快速检测单核细胞增生症李斯特菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性片段。这表明所扩增的hly基因3′末段850bp的DNA片段对单核细胞增生症李斯特菌具有较高的特异性。PCR对单核细胞增生症李斯特菌纯培养物的检测低限达10~5cfu·mL^(-1),对16hLEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR捡测,结果检测生猪肉低限达400cfu·kg^(-1)、水和牛奶为400cfu·L^(-1)。整个检测过程只需24h。这表明PCR法对单核细胞增生症李斯特菌的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG。然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)。将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109CFU,5×109CFU,1×1010CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性。在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重。以5×109CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P<0.01)。攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景。

新疆食源性单增李斯特菌MLST分型及耐药性分析

目的研究新疆食源性单增李斯特菌分型和耐药情况。方法将62株食源性和1株羔羊脑炎分离株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及耐药性实验。结果 63株单增李斯特菌分为20个ST型, 16个克隆群(clonal complex groups, CC),其中68.25%(43/63)属于谱系Ⅱ,其余属于谱系Ⅰ。优势ST型是ST8、ST9、ST121、ST87和ST378,优势CC群是CC8、CC9、CC1和CC121。对苄青霉素(penicillin, P)、氨苄西林(ampicillin, AM)、苯唑西林(oxacillin, OX1) 3种抗生素耐药率达100%;对庆大霉素(gentamicin, GM)、莫西沙星(moxifloxacin,MXF)、红霉素(erythromycin,E)、奎奴普丁/达福普丁(quinupristin,QDA)、利奈唑胺(linezolid, LNZ)、万古霉素(vancomycin, VA)、替加环素(tigecycline, TGC)、利福平(rifampin, RA)和诱导性克林霉素耐性(induced clindamycin resistance, ICR) 9种抗生素敏感率达100%;对呋喃妥因(furadantin, FT)耐药率61.90%(39/63),其中ST7、ST8、ST101、ST155和ST515对此次的3-4类药物表现出多重耐药性。结论新疆单增李斯特菌分子型别呈多样性,耐药谱变宽,存在较大的食品安全风险。

沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的建立沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法,提高检测效率和敏感性。方法选择沙门菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞李斯特菌溶血素基因序列设计引物,在单一PCR方法基础上,建立检测两种病原菌的多重PCR技术。结果在495bp和850bp处分别出现预期的特异性DNA扩增条带,敏感性试验显示该体系能检测出32pg的沙门菌DNA和274pg的李斯特菌DNA,样品检测表明该方法与单一PCR和国标方法的符合率达100%。结论本研究建立了能同时检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌的多重PCR技术,为主要食源性病原菌快速检测提供了新方法。