衰老与肿瘤专栏导读

随着人口老龄化问题的加剧,延长老年人的健康寿命和防治衰老相关性疾病已成为全球公共健康问题面临的重大挑战。组织中衰老细胞的大量积累是引起机体衰老和多种老年性疾病发生的重要原因。研究显示,衰老细胞向胞外分泌多种各类因子,包括多种细胞因子和趋化因子,生长因子以及蛋白酶等。

衰老相关分泌表型

细胞衰老是指细胞处于稳定的细胞周期阻滞状态,丧失了分裂增殖能力。多种细胞内外的刺激因素均可诱导细胞衰老。衰老的细胞表现出很多特征,例如细胞周期阻滞蛋白质p16^(INK4a)和p21^(Cipl)表达水平上调、DNA损伤反应、细胞结构和代谢的改变等。衰老细胞的另外一个主要特征是其会表达和分泌很多种因子,包括细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白酶以及其它生物活性分子等,被称为衰老相关分泌表型。这些因子通过细胞自主的自分泌方式或细胞非自主的旁分泌方式发挥较多生物学功能。在本综述中,我们总结了衰老相关分泌表型的组成,指出其组成具有高度的异质性和动态性。本文在转录、转录后、翻译、翻译后修饰、表观遗传等多种水平总结了其调控机制。之后总结了其多种生物学功能,包括其在抑制肿瘤、组织修复和胚胎发育中的有益作用,以及在诱导细胞衰老、促进肿瘤发生发展、衰老相关疾病和机体衰老中的有害作用。在应用上,本文概述了通过靶向清除衰老细胞和抑制衰老相关分泌表型来干预衰老和衰老相关疾病的治疗方法。最后,概述了在体内鉴别和检测衰老细胞和衰老相关分泌因子所面临的一些挑战,并提供了一些具有可操作性的建议以及新技术来解决这些挑战。

DNA去甲基化对细胞衰老的影响

5-氮杂胞嘧啶（5aZaC）为DNA甲基化转移酶的抑制剂，用它处理细胞，使基因组DNA去甲基化．结果发现，经5aZaC处理后的细胞衰老进程明显加快，这从另一侧面反映了DNA甲基化与细胞衰老的关系．

大鼠衰老过程中脑细胞DNA与c－Ha－ras原癌基因的甲基化

用ＭｓｐⅠ／ＨｐａⅡ酶解电泳法和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）两种方法进行比较，研究了不同年龄大鼠的肝、脑细胞基因组ＤＮＡ的甲基化程度。从酶解电泳图谱可观察到，肝、脑细胞基因组ＤＮＡ甲基化在青年鼠和老年鼠之间没有差异。但用具有高分辨率的高效液相色谱测量ＤＮＡ中５－ｍＣ的含量时发现，老年鼠脑细胞ＤＮＡ甲基化程度较大年鼠的下降６２％，而肝细胞ＤＮＡ甲基化程度在老年鼠与青年鼠之间并没有显著差异。这些结果提示：（１）用常规的酶解电泳法所分析的ＤＮＡ甲基化结果并不能反映整个基因组ＤＮＡ甲基化的水平。（２）衰老过程中，不同组织ＤＮＡ甲基化的改变存在差异，引起这种差异的原因可能与组织的增殖和分化程度有关。进一步分析脑细胞原癌基因ｃ－Ｈａ－ｒａｓ的甲基化水平，无论ＭｓｐⅠ酶切图谱，还是ＨｐａⅡ酶切图谱均可观察到分子大小为１９ｋｂ、７．５ｋｂ、１．３ｋｂ、０．９ｋｂ的四条阳性带，说明该基因未发生甲基化，且与年龄无关。

大鼠衰老过程中肝细胞活性染色质DNA的甲基化

用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法测定大鼠衰老过程中肝细胞活性染色质与非活性染色质ＤＮＡ甲基化程度的变化。结果表明，老年鼠肝细胞活性染色质ＤＮＡ甲基化程度较青年鼠的低，二者有显著性差异；而老年鼠肝细胞非活性染色质ＤＮＡ甲基化程度较青年鼠高，亦具有显著性差异，这表明衰老过程中基因组ＤＮＡ各组分甲基化程度的变化不一致。

衰老细胞转录因子AP_1/CREB结合活性对EGF的可诱导性下降

转录因子与ＤＮＡ的结合是基因转录的关键环节．通过迁移位移法分析了转录因子ＡＰ１、ｃＡＭＰ反应元件结合蛋白（ＣＲＥＢ）、糖皮质激素反应元件（ＧＲＥ）结合蛋白在衰老细胞中的结合活性．结果表明，ＡＰ１与ＣＲＥＢ的结合活性在衰老细胞中对表皮生长因子（ＥＧＦ）的反应性低于年轻细胞；而ＧＲＥ结合蛋白的结合活性在衰老细胞中对ＥＧＦ的反应性无明显变化．

DNA甲基化与衰老

DNA甲基化在基因表达调控和维持细胞的正常分化状态起着重要的作用。衰老过程中DNA甲基化水平的改变势必引起基因表达和细胞分化状态的异常,本文就DNA甲基化与衰老的关系综述如下。

人衰老成纤维细胞c-fos基因对DNaseⅠ的敏感性分析

目的：研究人衰老成纤维细胞c-fos基因染色质结构状态。方法：DNaseⅠ敏感性分析法。结果：衰老细胞c-fos基因在表皮生长因子（EGF）诱导后对DNaseⅠ的敏感性无明显变化，而年轻细胞对DNaseⅠ的敏感性显著升高。结论：衰老细胞的c-fos基因可能在异染色质上，处于关闭状态，因而不易为EGF所诱导。

人衰老成纤维细胞c-myc原癌基因的损伤修复

目的：观察人衰老成纤维细胞特异因基c-myc的损伤修复。方法；采用Southern杂交法。结果：衰老细胞能有效地修复c－myc基因。结论：衰老细胞能有效地修复对细胞存亡至关重要的基因。

IL-1和TNF-α拮抗剂治疗骨关节炎实验研究

目的:观察腺病毒载体介导的白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)和可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(sTNF-RI)基因转移对兔骨关节炎的治疗作用,并探讨IL-1和TNF-α在骨关节炎发生中的作用。方法:构建Ad-IL-1Ra和Ad-sTNF-RI腺病毒载体,注射到兔骨性关节炎膝关节腔内。关节内注射腺病毒后第3天和第7天,分别用1ml生理盐水灌洗膝关节,抽取关节腔灌注液采用ELISA分析外源基因的表达。第7天处死动物,取膝关节股骨内侧髁软骨和滑膜常规石蜡切片,软骨HE染色、甲苯胺蓝染色和滑膜组织HE染色检查病理改变,并进行软骨组织学评分。结果:膝关节内注射IL-1Ra能明显抑制关节软骨的破坏,但对滑膜炎无明显治疗作用;单独sTNF-RI基因治疗对关节软骨的破坏和滑膜炎均无明显的作用。结论:IL-1Ra对骨关节炎关节软骨有明显的保护作用,而sTNF-RI对骨关节炎无明显的治疗作用,这提示在骨关节炎的发生中IL-1可能起主要的作用,因而抑制IL-1的作用对骨关节炎的治疗更为有效。

小江断裂带南段全新世活动的地质地貌证据与滑动速率

小江断裂带南段位于近SN向的鲜水河-小江断裂系与NW向的红河-哀牢山断裂系的交会地带。在遥感影像上,小江断裂带南段线状特征清楚,且连续分布,表现为1条贯通的、单一的断裂构造,全长约70km,总体走向N20°E左右,中间呈略向E凸出的弧形。在龙潭村两岔河一带,沿着该断裂段存在比较典型的山脊、冲沟同步左旋位错现象。在跨断塞塘开挖的探槽剖面上,断裂分布状况、断错地层的沉积学特征、产状变化以及初步年代测试结果揭示了3次明显断错地表的古地震事件,显示了小江断裂带南段具有重复孕育和发生强震的能力。利用Trimble 5800 GPS实时差分测量系统,对两岔河地区存在典型同步位错特征的2条冲沟及其它们中间的台地进行了精细测量,位错量为(18.3±0.5)m;T_2阶地面是断裂西盘2条冲沟之间及其邻近地带的最高层状地貌面,通过不同深度年代数据的线性回归分析,该地貌面停止接受沉积的时代约为2606a BP。根据地质方法获得了小江断裂带南段全新世左旋走滑速率为(7.02±0.20)mm/a,与利用GPS数据获得的结果有着较好的一致性。对小江断裂带南段活动性和滑动速率的初步研究结果表明,在滇东南地区不存在川滇块体向S或SSE方向滑移被曲江断裂和石屏-建水断裂挤压变形吸收、而使得小江断裂带南段左旋走滑速率大幅度减小的现象,该断裂段是1条活动性明显的全新世断裂。这些初步认识为小江断裂带南段的未来地震危险性评价以及川滇地区的地震构造模型建立和检验提供了可以借鉴的基础地质资料。

青藏高原东北缘冷龙岭断裂全新世左旋滑动速率

冷龙岭断裂是青藏高原东北缘1条重要的左旋走滑断裂,断裂滑动速率对于青藏高原东北缘构造形变的动力学研究以及认识断裂的活动习性和地震危险性具有重要意义。但是,冷龙岭断裂的滑动速率仍然存在较大争议,被限定在3~24mm/a一个较为宽泛的范围内。文中以青海省门源县他里花沟上游走滑断裂断错地貌现象较为典型的牛头沟地区(37.440 2°N,102.094 0°E)和柴陇地区(37.447 3°N,102.063 0°E)作为研究对象,采用地基LiDAR获取的高分辨率DEM和高精度Google Earth卫星影像对断错地貌进行了位错演化模式分析和位错量的恢复测量,结合地貌面上开挖地层探坑和剥离新鲜地层剖面上的年代样品采集与测试,确定了断错地貌面的废弃年代。在牛头沟地区和柴陇地区得到的滑动速率分别为(6.4±0.7)mm/a和(6.6±0.3)mm/a,2个研究地区获得的结果存在较好的一致性。考虑到滑动速率的误差范围,认为冷龙岭断裂全新世以来的左旋滑动速率为(6.4±0.7)mm/a,该滑动速率介于前人采用地质方法获得的结果中间,也在In SAR得到的滑动速率4.2~8mm/a范围内,但比GPS速率((4.0±1.0)mm/a)稍大。祁连-海原断裂带弧形分布的晚第四纪滑动速率在冷龙岭地区达到最大,青藏高原东北缘在该地区最强烈的隆升也从1个侧面证实了冷龙岭断裂在调节青藏高原相对于戈壁-阿拉善地块向E运动方面所处的重要地位。

骨性关节炎的联合基因治疗研究

目的:探讨白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)及白细胞介素10双基因转染在关节中的表达及在骨性关节炎(OA)治疗中的作用。方法:构建PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10逆转录病毒载体,体外转染同种异体原代滑膜细胞,将转染了外源基因的滑膜细胞注射入兔骨性关节炎膝关节腔。外源基因注射后第7天,用PBS灌洗兔膝关节,ELISA分析转基因表达;外源基因注射后第14天处死动物,ELISA及免疫组化分析转基因表达,软骨滑膜常规石蜡切片观察病理改变,并进行软骨组织学评分。结果:外源基因转移后14天表达尚很稳定,治疗基因在受体关节的滑膜衬里部位表达。只接受人IL-1Ra基因治疗的兔膝关节软骨损坏明显减轻;单纯人IL-10基因治疗膝关节也有一定效果;两种基因同时导入时,有非常明显的抑制软骨破坏和软骨基质降解的作用。结论:以逆转录病毒为载体将IL-1Ra、IL-10同时转移入早期骨关节炎关节内,有稳定的外源基因表达,且联合基因治疗效果明显优于单独转移入其中任何一种基因,提示靶向于多种炎性因素的治疗更为有效。

组织特异性启动子介导的反义FGF8b RNA对前列腺癌细胞生长增殖能力的影响

利用启动子的组织特异性和治疗基因组织特异表达的特点 ,设计出前列腺癌靶向基因治疗的新方案 .利用DNA重组技术将前列腺组织特异性启动子 (probasin基因启动子 )和在前列腺癌细胞中高表达成纤维细胞生长因子 (FGF) 8b反义cDNA克隆到逆转录病毒载体pSIR中构建成重组体PB 反义FGF8b pSIR .经转染包装细胞PT 6 7后将产生的复制缺陷型逆转录病毒体外感染前列腺癌细胞系PC 3M ,体外检测其生长增殖和侵袭转移能力的变化 .结果表明 ,与对照组相比 ,前列腺癌细胞感染产生反义FGF8bRNA的逆转录病毒后生长速度减慢 ,集落形成能力下降 ,体外侵袭转移能力降低 (P <0 0 1) .体外试验表明 ,前列腺组织特异性启动子介导的反义FGF8bRNA可有效降低前列腺癌细胞的体外生长增殖和转移能力 ,这为体内靶向前列腺癌基因治疗奠定了可靠的基础 .

安徽巢湖--铜陵地区中强地震发生的构造标志

安徽巢湖—铜陵地区是中国大陆内部1个典型的中强地震活动区,曾发生的1585年巢县南5级、1654年庐江东南5级等4次地震呈NNE向带状展布,构成了1条醒目的中强地震活动带。野外地表地质调查、浅层物探、钻探资料、年代学样品的采集测试和断裂活动性综合分析等表明该地区矾山断裂、夏家岭断裂和朗村断裂是前第四纪断裂。铜陵断裂是1条中更新世活动的隐伏断裂,可发生中强地震,控制了近地表的3个雁列状构造的演化和发展。4次地震强度呈现了向S递减的特点,而这与晚新生代无为盆地的凹陷幅度明显大于南边的贵池盆地的特点相一致。在深部构造上,铜陵断裂空间分布特征对应着1条NNE向布格重力异常梯级带。巢湖—铜陵地区中更新世活动的铜陵断裂、雁列状分布的构造、新构造的差异运动以及布格重力异常梯级带与该地区中强地震活动带在空间上的对应性,显示了它们应是中强地震孕育和发生的构造标志。

逆转录病毒载体PLXRN介导的人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的表达

目的:建立逆转录病毒介导的人IL-1Ra体外表达体系。方法:应用DNA重组技术,将人IL-1RacDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXRN中,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染原代关节滑膜细胞,用ELISA检测IL-1Ra表达。结果:重组pLXRN-IL-1Ra质粒,经酶切鉴定正确。重组逆转录病毒pLXRN-IL-1Ra滴度可达5.5×104CFU/ml,感染原代关节滑膜细胞后能稳定表达。结论:逆转录病毒能介导人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的稳定表达,为下一步开展基因治疗运动创伤性骨关节炎奠定了基础。

壳聚糖载体介导的骨关节炎基因治疗

目的:探讨由壳聚糖载体介导的骨性关节炎的基因治疗。方法:分别制备壳聚糖pcD-NA3.1-IL-1Ra和壳聚糖pcDNA3.1-IL-10纳米粒复合物,采用该复合物转染体外培养的正常原代兔关节软骨细胞,并将其作为药物直接注射进骨关节炎模型兔关节腔内。分别采用RT-PCR、ELISA和免疫组化方法从mRNA水平和蛋白水平检测目的基因的转染情况,并对治疗后实验动物的关节软骨和滑膜进行大体组织学观察。结果:正常原代软骨细胞转染后,在mRNA水平上检测到外源基因的水平升高;体内转染后,在蛋白水平上检测到目的蛋白在关节软骨内有阳性染色,且经基因治疗的兔关节软骨的破坏程度明显轻于未经基因治疗的对照组。结论:壳聚糖是一种较理想的基因载体,可用于早期骨性关节炎的基因治疗。

垂体瘤转化基因1(PTTG1)的表达变化对人前列腺癌细胞LNCaP生长增殖的影响

垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)具有促进肿瘤生长和转移的作用.通过上调或下调基因表达的策略,观察PTTG1基因对人前列腺癌细胞株LNCaP细胞生长增殖的影响.利用PCR技术分离出PTTG1全长cDNA,分别正向和反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP,重组载体分别命名为正义PTTG1-S/pIRES2-EGFP(即pI-P-S)和反义PTTG1-AS/pIRES2-EGFP(即pI-P-AS),将这两种重组载体稳定转染LNCaP细胞,通过流式细胞仪和MTT法分别检测了细胞周期和细胞增殖的情况.转染正义PTTG1后处于S期和G2期的细胞明显增加,细胞生长增殖能力增强;相反,转染反义PTTG1后处于S期和G2期细胞明显减少,细胞生长增殖能力减弱(P<0.05).结果表明,PTTG1能明显改变人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞周期和细胞生长增殖能力,它的异常表达可能参与前列腺癌细胞生长增殖过程.

核转录因子激活蛋白-1对PPARδ表达的调控作用

目的研究在过氧化物酶体增长因子活化受体δ(PPARδ)表达中的相关调控因子.方法用RT-PCR扩增人类PPARδ启动子序列,通过Deletion及重组将不同长短的PPARδ启动子序列转化到PGL3-basic载体中,转染LOVO细胞,通过观测各重组体转染活性,确定PPARδ启动子活性区域.再通过电泳迁移率变更分析(EMSA)、突变等方法确定核转录因子激活蛋白-1(AP1)对PPARδ表达的作用.结果 Deletion及重组转染后发现PPARδ启动子活性区域在序列3361～3464之间,EMSA、突变发现AP1因子结合位点突变后转染活性明显降低.结论 AP1因子结合位点突变后转染活性明显降低,提示AP1是PPARδ的一个增强子.

H_2O_2诱导的2BS早老细胞中自噬体增多

自噬在细胞复制性衰老中起着重要的作用.然而,早老细胞中的自噬现象基本无相关的报道.本文通过外源性过氧化氢(H2O2)的诱导,构建人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS细胞)早老模型.首先,通过SA-β-gal染色,验证细胞早老;从形态学和特异标志分子及雷帕霉素作用的靶位点(mTOR)信号通路不同角度检测自噬的变化,其中形态学检测包括丹(磺)酰戊二胺(MDC)自噬分子定量法及电镜自噬超微结构的观察;特异标志分子LC3的检测包括GFP-LC3自噬定位法和免疫印迹法检测LC3;及检测mTOR信号通路下游激酶p70S6蛋白的表达变化.结果表明,过氧化氢诱导的早老细胞中自噬体相对年轻细胞明显增多,且具有保护早老细胞的作用.