副溶血弧菌ZJ2003株两种铁调外膜蛋白的克隆、表达和免疫原性

从浙江省象山港网箱养殖大黄鱼病鱼分离的一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ZJ2003中克隆了两种铁调外膜蛋白psuA和pvuA的基因(GenBank登录号:DQ141607、DQ141608),经PCR的方法去除两基因的信号肽编码序列后亚克隆到原核表达载体pET30a(+)中,经IPTG诱导获得大量表达。表达的重组蛋白以包涵体形式存在。包涵体蛋白经尿素法纯化及梯度透析法复性后以100μg/尾的剂量免疫大黄鱼,4周后经活菌攻毒获得80%的免疫保护率。免疫印迹分析表明,人工感染存活鱼的血清可以识别此两种重组蛋白。研究结果显示该两种铁调外膜蛋白具有良好的免疫原性,有可能作为高效疫苗成份。

黑鲷肠炎病原恶臭假单胞菌的分离和鉴定

2008年3月,浙江省象山港养殖黑鲷暴发了严重的肠炎病情,病鱼肠道肿胀,充满黄色黏液。以ZoBell2216E平板自病鱼肠道黏液分离到4株菌BB01、BB02、BB03和BB04。通过人工感染试验验证了前3株为病原菌,其中BB01菌株96h的半数致死浓度LD50为4.61×104CFU/g鱼体重。3株分离菌革兰氏染色阴性,短杆状,氧化酶试验阳性,氧化葡萄糖,不产气,4℃生长,精氨酸双水解酶阳性,利用麦芽糖、柠檬酸盐,硝酸盐降解阳性,DNA酶、乙酰胺酶阴性;与已发表的恶臭假单胞菌16SrRNA序列的同源性达99%以上;经形态和理化特性鉴定及16SrDNA序列测定,此3株菌同属于恶臭假单胞菌。药敏试验结果表明,菌株BB01对头孢类等多数抗生素种类敏感,而对氧氟沙星耐药。

两株鱼源琼氏不动杆菌的分离、鉴定和耐药特性分析

为探明史氏鲟感染性疾病的病原,并为生产中防治该病提供依据,本实验自患病鱼分离到2株细菌SX01和SX02,对2分离株开展了人工感染实验、形态学和理化特性检测及分子生物学鉴定,并用PCR法检测了部分耐药基因。研究结果表明,分离株对异育银鲫具有一定的致病力,96 h的半数致死浓度LD50为1.02×109cells/mL;革兰氏染色阴性,球杆状,氧化酶实验、动力阴性,接触酶阳性,形态学和理化特性符合不动杆菌属的特征;其16S rRNA基因序列与已发表的琼氏不动杆菌完全同源,RNA聚合酶β亚单位编码基因rpoB序列与琼氏不动杆菌相应序列同源性达99%以上,确认2分离株为琼氏不动杆菌;自分离株中检测到了广谱性β-内酰胺酶编码基因TEM-1和氨基糖苷类乙酰胺转移酶基因Aac(3)Ⅱ,解释了该菌对2类抗生素药物的耐受性,提示了该菌可能来源于临床菌的污染,养殖行业和食品卫生中必须引起重视。

养殖池水中浮游植物与细菌关系的初步研究

在实验条件下检测了不同组成和数量的浮游植物对养殖池水细菌数量２４ｈ变化的影响。结果表明，在无浮游动物的自然养殖池水中，２４ｈ内细菌数量白天增长，夜晚下降，翌日晨下降至最低点。降低自然养殖池水中的浮游植物数量和改变其组成后，２４ｈ内细菌数量持续增长。在灭菌养殖池水中加入一定量的浮游植物和大肠杆菌，１ｄ后细菌总量有一定下降；只加入大肠杆菌的灭菌池水，３ｄ后细菌数量有较大增长。本研究证明养殖池水浮游植物种群和数量与细菌密度之间存在制约关系。

几种抗生素对养殖池水浮游生物的影响

试验表明，水中土霉素、红霉素和氯霉素达２５０μｇ／ｍＬ以上时，浮游动物出现不同程度的不适反应，部分轮虫和枝角类释放出休眠卵并出现死亡。红霉素的质量浓度低于５μｇ／ｍＬ时，３ｄ内浮游植物的种类和数量与对照水样相比，变化不明显。

自黑鲷肠道分离一株发光细菌的种类鉴定及其发光特性的研究

从浙江省象山港网箱养殖黑鲷(Sparus macrocephlus)肠道分离到一株发光细菌LB01,经过形态观察、生理生化特性测试和16S rRNA基因序列分析,确定这株菌属于鳆发光杆菌(Photobacteria leiognathi)。同时对这株菌的发光条件和发光特点进行了初步研究,结果表明,LB01在470 nm左右出现最大发射波长,在pH值5.0～6.0,温度20℃左右,NaCl浓度3%左右等条件下发光最强。

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达

根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX4T2构建重组表达质粒pGEX4TOmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GSTOmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Westernblotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。

投喂中草药对大黄鱼几种免疫酶活性的影响

以不同中草药配制的药物饵料投喂大黄鱼,比较大黄鱼的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等非特异性免疫指标及对致病性假单胞菌人工感染抵抗力的差异。试验结果表明,投喂不同中草药饲料28d内,血清溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶均随饲料投喂时间的延长而升高;投喂28d后,各试验组血清溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性均显著高于对照组(P<0.05),其中党参组大黄鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著高于其他组(P<0.05);在假单胞菌人工感染中,黄芩组、黄芪组和党参组表现出一定水平的保护力,其他中药组没有明显保护效果。本研究提示,饲料中添加黄芪、黄芩和党参能有效提高大黄鱼非特异性免疫功能,但不足以保护免于特异性的感染。

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU的克隆、表达与免疫原性研究

根据已发表的哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应（PCR）方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a（＋）-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21（DE3）,在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到初步纯化的重组蛋白,以50μg/mL的剂量注射免疫大黄鱼幼鱼,经间接ELISA法检测了4-8周后特异性抗体的效价,同时检测了注射后4周的免疫保护率。结果表明,4-8周内特异性抗体效价持续升高,达到log28.0以上,4周时的相对免疫保护率为85%。试验结果显示了重组哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗的开发对象。

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。

福建爱德华氏菌对土霉素、氯霉素和链霉素的感受性、耐药性研究

本研究在试管内测定福建爱德华氏菌对土霉素、氯霉素和链霉素的最小抑菌浓度分别为５０ｕｇ／ｍｌ，３．１２ｕｇ／ｍｌ和０．３９ｕｇ／ｍｌ。在２５℃下经药物浓度递增继代培养，该菌株对这３种抗生素的最小抑菌浓度分别上升了１６倍，３２倍和６４倍。而对已获得耐药性的菌株进行无添加药物继代培养９次、１２次和１１次后，对土霉素、氯霉素和链霉素的敏感性又回复到了初始水平。

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK真核表达载体构建及在毕赤酵母中的表达

采用已构建的原核重组质粒pET30a-OmpK为模板,通过PCR扩增OmpK成熟肽基因片段,引入酶切位点后克隆至分泌表达载体pPIC9K,经SalⅠ线性化后,氯化锂法转化至毕赤酵母GS115中,并经G418遗传霉素筛选高拷贝酵母转化子,最后进行甲醇诱导表达,表达上清经SDS-PAGE电泳检测及Western-blot鉴定,表明重组蛋白已经表达。

宁波地区贝类产品中副溶血弧菌的分离与鉴定

从2007年3月至6月,在宁波市5个不同的农贸市场共采集贝类样品360份,分离菌株71株,其中5株代表菌株革兰氏染色阴性、弧状、具极生单鞭毛,利用葡萄糖、甘露醇产酸,不利用乳糖、蔗糖,精氨酸双水解酶阴性,VP试验为阴性,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶为阳性,靛基质、甲基红试验阳性,不产生H2S,初步判断为副溶血弧菌;进一步进行了基于16S rRNA和toxR序列的PCR检测,序列测定结果验证了该5株细菌确实为副溶血弧菌。以16S rRNA序列为基础,分析了分离株与相关细菌菌株的同源性,构建了系统发育树。

鲈鱼白细胞介素-8 cDNA序列的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%～48%和25%～92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,Western-blotting检测结果显示,目的蛋白能与抗6×His单克隆抗体发生特异性反应。

Screening and Identification of Amylase-producing Strain from Arctic Ocean and Optimization of Enzyme Producing Conditions

[Objective] The aims were to investigate the screening and identification of amylase-producing marine bacteria from Arctic sea and the optimization of the amylase producing conditions. [Method] A high-yield strain for producing amylase named ArcB84A was isolated from a total of 156 marine bacteria of Arctic sea. Then,the morphological identification of the strain,molecular identification of 16S rRNA and optimization of fermentation conditions were conducted. [Result] ArcB84A strain was a member of Pseudoalteromonas genus. The optimum conditions for enzyme production of B84A strain included that,the initial pH value of the medium was 7.0-8.0,and the best carbon and nitrogen sources respectively were 5‰ glucose and peptone. Surfactants including TritonX-100,Tween20 and Tween80 could increase amylase activity of the strain,in which,the effect of 10‰ Tween80 was the most obvious.

大黄鱼α-珠蛋白cDNA的克隆及其特性分析

采用3'末端快速扩增法,首次从大黄鱼中克隆到564bp的血红蛋白α亚基cDNA。该序列包含435bp的开放读码框和126bp的3'末端非编码区,编码144个氨基酸的多肽。计算其可能的相对分子质量为15 930D,等电点为9.27,推导的氨基酸序列与其它13种鱼及人血红蛋白α亚基进行同源性比较,其同源性在35.7%￣70.3%之间,它与同属真口鱼纲的草鱼、大西洋鲑鱼、金鱼、虹鳟、金枪鱼、电鳗等的同源性较高,而与肉鳍鱼纲的肺鱼及板鳃纲的鲨鱼的同源性较低,而且发现该序列在CD5(第48位)处插入了一个独特的甘氨酸残基,在近端与血红素结合的F8(第90位)的组氨酸高度保守。

溶藻弧菌铁调蛋白基因的克隆、表达及其特征分析

铁为一切有机体所必需。对铁摄取与利用的调控在细菌生长和铁毒性中起重要作用。在革兰氏阴性细菌中,铁摄取调节蛋白(Fur)主管铁的代谢。溶藻弧菌是人和海洋动物共感染的一种主要病原弧菌。本研究克隆表达了溶藻弧菌的fur基因,并分析了其相关特征。该基因序列全长994 bp,其中包含450 bp的开放读码框,编码150个氨基酸残基的蛋白,推导的相对分子量为16.78 kD.在编码序列的上下游,RBS序列-、10序列-、35序列和二个潜在的转录终止子分别得到确定,但没有发现存在于大肠杆菌fur基因中的"铁盒子"。氨基酸序列的中段从G46位至D104位,为高度保守区域,其中包括含组氨酸丰富铁结合模型(H3-D-H-L-V-C-L-D-C-G)。SDS-PAGE分析表明,fur基因可在大肠杆菌中大量表达,带His-Tag的重组融和蛋白经镍亲和层析得到纯化,Western-blot分析结果显示,Fur蛋白具有免疫反应性。为进一步研究Fur蛋白的结构与功能打下基础。

北冰洋产淀粉酶海洋细菌的筛选与鉴定及其产酶条件的优化

[目的]筛选与鉴定北冰洋产淀粉酶海洋细菌,并对筛选出的细菌进行产酶条件优化。[方法]从156株北冰洋海洋细菌中筛选出淀粉酶高产菌株Arc B84A,并对其进行了菌株形态学鉴定、16S rRNA分子鉴定以及产酶条件优化。[结果]菌株Arc B84A属于交替假单胞菌属。菌株Arc B84A的最佳产酶条件为:培养基起始pH值为7.0～8.0;最佳碳源为0.5%葡萄糖;最佳氮源为1.0%蛋白胨;Tri-tonX-100、Tween-20、Tween-80等表面活性剂可以提高菌株淀粉酶活性,其中1.0%Tween-80的效果最为明显。[结论]该研究为海洋细菌淀粉酶的生产与应用提供了理论依据。

宁波-舟山港口航道3种致病性细菌毒力特征与耐药性

本文调查分析了宁波-舟山港口航道副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的毒力特征和耐药性特点。用PCR方法检测分离菌株的毒力基因分布模式发现,副溶血弧菌毒力基因型以gyrB^+,toxR^+,tlh^+和tdh^+为代表,溶藻弧菌毒力基因型以aspA^+,tlh^+,collagenase^+和toxS^+为代表,嗜水气单胞菌毒力基因型以aerA^+,alt^+,aha1^+和hlyA+为代表;副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌代表菌株相应基因的检出率分别为57.1%、40.0%和50.0%。用24种常见抗生素对3种细菌的分离代表菌株进行药敏调查,耐药率分别为4.17%、8.33%和29.17%。实验结果表明宁波-舟山港口航道3种致病性细菌具备较丰富的毒力基因种类和耐药性,需要有针对性地制定预防措施。此外,鉴于毒力基因型与致病性之间的相关性,毒力基因可作为标记基因,用于致病性细菌的检测。

宁波-舟山港口航道水域致病性细菌的毒力基因型鉴定

根据标准对宁波-舟山港口航道致病性细菌进行分离,结合16S r DNA等方法鉴定分离菌株,研究其生理生化特征,通过PCR方法判断其毒力基因型,分析危害风险.结果表明,4个样品采集区的样品经分离鉴定,菌种分别为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等9种,其中粪肠球菌分离率最高.各种细菌的生理生化及形态特征与已报道陆源细菌相近,携带毒力基因型多样性丰富,提示具备致病力.运行Blast程序对所有分离株16S r DNA序列进行比对,发现与已知序列相似度均在98%以上.研究结果对海洋微生物的毒力基因多样性研究以及危害风险评估提供了基础.