优质食品酶的催化机制及在高端配料创制方面的应用基础

优质食品酶是食品生物加工的核心,是食品制造产业的“芯片”。我国食品酶领域的应用基础研究薄弱,70%以上的酶制剂市场被国际公司垄断,优质食品酶长期受制于人,难以支撑目前食品行业提质升级的发展需求。在此背景下,本文聚焦新型食品酶高效筛选和分泌表达的生物学基础,高端高值食品酶的催化机制,食品酶催化性能改造的结构基础,食品酶创制高端配料的内在规律及作用机制等关键科学问题,综述优质食品酶的催化机制及在高端配料创制方面的应用基础,旨在为食品高端配料的酶法创制提供理论和实践指导。

添加部分水解罗望子胶对酸木瓜果醋品质的影响

该研究以酸木瓜(Chaenomeles speciosa)为原料,通过部分水解罗望子胶(PHTG)对6株乳杆菌的增殖活性测定,选用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)与酵母菌混菌进行酒精发酵,并从灵石醋醅中筛选鉴定出一株高产醋酸的巴氏醋杆菌巴士亚种(Acetobacter pasteuranus subsp. pasteuranus)LS-4用于醋酸发酵制备酸木瓜果醋。以未添加PHTG为对照,考察在酒精发酵阶段添加PHTG对酸木瓜果醋品质的影响。结果表明,添加1.0%PHTG,酒精发酵36 h后酒精度达3.3%vol,比对照组提高17.4%;醋酸发酵72 h后总酸含量达42.0 g/L,比对照组提高8.0%。香气成分分析表明,添加PHTG酸木瓜果醋共检出22种香气成分,其中醇类7种、酯类4种、酸类6种、醛酮类3种、酚类和烯烃类各1种,比对照新增了3种香气成分(正丁酸、2-戊酮和壬醛)。感官评价表明,添加PHTG有效提升酸木瓜果醋的口感和气味评分,改善酸木瓜果醋的感官品质。

褐藻寡糖对N^(G)-硝基-L-精氨酸甲酯诱导小鼠高血压的改善作用

目的:研究褐藻寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)对N^(G)-硝基-L-精氨酸甲酯(N^(G)-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)诱导小鼠高血压的改善作用及其机制。方法:采用AOS预防性干预高血压小鼠6周,监测小鼠血压,观察小鼠肾脏、心脏和主动脉组织病理形态学变化并测定其氧化应激水平及血清中总抗氧化能力、一氧化氮、血管紧张素II和内皮素-1等水平,同时检测主动脉中内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)蛋白表达情况。结果:给药1.5 g/kg AOS能够有效降低L-NAME诱导高血压小鼠的收缩压(22.4 mmHg),明显改善肾脏、心脏和主动脉的组织形态,减轻氧化应激损伤;血清中尿素氮、肌酐、尿酸、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、血管紧张素II和内皮素-1水平比模型组小鼠分别降低38.0%、46.5%、45.2%、15.9%、46.4%、29.5%和26.2%,而总抗氧化能力和一氧化氮浓度分别提高24.1%和246.5%;主动脉中eNOS蛋白表达显著增加152.9%。结论:AOS对小鼠具有降血压作用,能够抑制高血压诱发的氧化应激和改善血管内皮功能障碍,本研究可为将AOS作为抗高血压功能食品配料提供科学依据。

瓜尔豆胶甘露寡糖对链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠的降血糖作用

目的:研究瓜尔豆胶甘露寡糖(guar gum manno-oligosaccharides,GMOS)对链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠的降血糖效果及作用机制。方法:采用GMOS干预糖尿病小鼠6周,监测小鼠体质量和胰岛素抵抗状态变化并测定血清中葡萄糖、胰岛素、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)等糖脂代谢相关指标水平,观察肝脏组织形态学变化,同时检测肝脏中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPk)/过氧化物酶增殖活化受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)信号通路相关蛋白的表达情况及抗氧化酶活性。结果:GMOS可以有效缓解糖尿病小鼠体质量减轻,明显改善其葡萄糖耐量(30.3%)和胰岛素敏感性(34.6%);体内葡萄糖、糖化血清蛋白和LDL-C含量较模型组小鼠分别降低38.6%、29.5%和27.3%,而胰岛素和HDL-C水平显著提高;有效减轻肝组织氧化损伤,激活肝脏AMPk/PGC-1α信号通路,提高肝脏内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。结论:GMOS具有降血糖效果,能够改善由糖尿病引发的糖脂代谢紊乱和氧化应激,具有作为抗糖尿病功能性食品配料的潜力。

基于模块优化强化大肠杆菌合成乳糖-N-新四糖的研究

乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)作为人乳寡糖核心组分之一,在婴幼儿成长发育过程中发挥着重要作用。为寻找高效的LNnT生物合成方法,探究模块优化对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ为出发菌株,根据合成路径中的关键代谢物质将LNnT合成路径划分为:外源酶所在路径的模块A,UDP-半乳糖合成路径的模块B和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成路径的模块C。利用不同拷贝数质粒初步优化模块A、B和C的表达强度,当大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ共表达重组质粒pRSF-lgtA-A.act和pET-galE时,LNnT产量最高,达0.87 g/L。通过CRISPR/Cas9技术敲除setA和ugd强化模块A和模块B,获得的重组菌株E20合成LNnT产量达1.16 g/L。摇瓶发酵条件优化后,重组菌株E20合成LNnT产量达1.28 g/L。在5 L发酵罐中,LNnT分批补料发酵产量达15.53 g/L,发酵过程最高生产强度为0.43 g/(L·h)。模块优化强化大肠杆菌高效合成LNnT有望为人乳寡糖的高效生物合成提供理论基础,进而推进婴幼儿配方食品产业的革新。

工程大肠杆菌利用甘油和乳糖高效合成2’-岩藻糖基乳糖

本实验在大肠杆菌BL21star(DE3)中构建2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)的从头合成途径,通过CRISPR/Cas9系统敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ,探究不同来源α-1,2-岩藻糖基转移酶对2’-FL合成的影响,调控合成途径基因的转录水平,并进行工程菌发酵条件优化。结果表明,初始工程菌摇瓶发酵72 h后2’-FL产量为0.34 g/L,敲除lacZ和wcaJ基因后发酵72 h合成的2’-FL质量浓度提高到2.12 g/L。脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)来源α-1,2-岩藻糖基转移酶WcfB产量提升效果最好,摇瓶发酵合成的2’-FL质量浓度达4.12 g/L。经发酵条件优化,工程菌BLW-2在28℃和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度0.2 mmol/L条件下,摇瓶发酵合成的2’-FL质量浓度提高至5.01 g/L,5 L发酵罐中分批补料发酵合成的2’-FL质量浓度达31.2 g/L。

部分水解瓜尔豆胶对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的作用

为探究部分水解瓜尔豆胶(partially hydrolyzed guar gum,PHGG)对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的作用,采用PHGG饮食干预APP/PS1小鼠3个月,通过水迷宫和避暗实验评价小鼠学习记忆能力,并观察其脑组织形态学变化及神经元数量;利用免疫印迹实验测定小鼠脑组织中凋亡相关蛋白的表达;同时采用免疫荧光法检测小鼠脑中β淀粉样蛋白和磷酸化Tau蛋白的表达情况。研究结果表明:与模型组相比,PHGG干预明显改善APP/PS1小鼠反应性、皮毛粗糙度和脊柱后凸;PHGG组小鼠进入目标象限的时间、距离和穿越平台的次数,比APP/PS1小鼠分别增加了81.6%、58.0%和171.4%(P<0.05)。PHGG干预显著增加了APP/PS1小鼠大脑皮层和海马区神经元数量,全脑组织中Bcl-2/Bax蛋白表达率比APP/PS1小鼠增加了54.9%(P<0.05);PHGG使得小鼠大脑皮层和海马区β淀粉样蛋白表达量分别降低了32.0%和55.0%(P<0.05),磷酸化Tau蛋白表达量则分别降低了52.3%和62.6%(P<0.01)。同时,PHGG干预显著下调了APP/PS1小鼠全脑组织中TLR4和NF-κB蛋白的表达,降低比例分别为42.0%和46.8%(P<0.05)。PHGG显著改善了阿尔茨海默病小鼠的认知障碍,能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻大脑皮层和海马区的细胞凋亡和神经元损伤。研究旨在为PHGG在抗阿尔茨海默病功能性食品配料的开发方面提供科学依据。

棉籽蛋白ACE抑制肽的酶法制备及其体外稳定性研究

食源性血管紧张素转化酶(angiotensin-I-converting enzyme,ACE)抑制肽因安全、无副作用、易吸收等优点,对防治高血压、提高居民健康水平具有重要作用。利用碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解棉籽蛋白制备ACE抑制肽,通过单因素实验优化水解条件,分离纯化水解物并鉴定其活性肽段组成,评价水解物的体外消化吸收稳定性。结果表明,棉籽蛋白经复合蛋白酶(1500 U/g)在pH值为8.0和55℃下水解5 h,蛋白回收率为39.8%,ACE抑制率可达93.7%。棉籽蛋白复合蛋白酶水解物经分离得到5个组分,其中组分4(F4)的ACE抑制活性最高(IC_(50)=220.1μg/mL)。从该组分中发现3条新型ACE抑制肽:VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET,其中LLSQTPRY的活性最高(IC_(50)=105.2μmol/L)。经人工胃肠液消化和Caco-2细胞单层膜吸收后,棉籽蛋白复合蛋白酶水解物仍具有一定ACE抑制活性,分别为53.8%和20.5%。研究结果表明,棉籽蛋白的复合蛋白酶水解物有望作为一种功能性食品配料,用于开发降压食品。

魔芋甘露寡糖对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的调节作用及机制

魔芋甘露寡糖(konjac mannan oligosaccharides,KMOS)具有多种有益人体健康的功能活性,但目前尚缺乏其对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的调节作用及机制方面的研究。采用高脂饮食(high fat diet,HFD)饲喂ApoE^(-/-)小鼠14周,建立AS模型,探究KMOS干预后小鼠主动脉脂质堆积和血清脂质、炎症因子等的变化,并运用高通量测序技术,分析KMOS对于AS小鼠肠道菌群的调节作用。研究结果表明:KMOS干预显著抑制了HFD诱导引起的ApoE^(-/-)小鼠体质量和肝脏质量的增加,主动脉窦的斑块病变面积比和总面积较HFD组分别降低57.4%和57.9%;血清中总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇含量分别降低21.1%和31.1%,高密度脂蛋白胆固醇含量增加了63.0%,AS小鼠肝脏脂质堆积情况明显改善;与AS模型组相比,KMOS组小鼠血清炎症因子(肿瘤坏死因子α、白介素-6、白介素-1β和单核细胞趋化蛋白-1)含量显著降低,肝脏胆固醇逆向转运相关基因的表达显著提高;此外,KMOS抑制了HFD诱导引起的ApoE^(-/-)小鼠肠道菌群失调,增加了g_norank_f_Lachnospiraceae、g_Alistipes、g_norank_f_Ruminococcaceae的相对丰度;同时,KMOS可以增加小鼠盲肠短链脂肪酸含量,促进肠道紧密连接蛋白表达以抑制小鼠肠道屏障功能损伤。因此,KMOS可能通过调节胆固醇代谢和肠道菌群,抑制HFD诱导的ApoE^(-/-)小鼠AS的发展,研究结果旨在为KMOS相关功能性食品的开发提供理论依据。

毛壳霉木聚糖酶B(CsXyn11B)的分泌表达及其在面包中的应用

目的:对毛壳霉(Chaetomium sp.)CQ31木聚糖酶B(CsXyn11B)进行分泌表达,以提高产酶水平并探究在面包烘焙中的应用价值。方法:将木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达,高密度发酵提高其产酶水平,对酶学性质进行表征并将其应用在面包烘焙中。结果:重组菌经高密度发酵156 h,木聚糖酶酶活力为2788 U/mL。CsXyn11B最适pH为8.0,最适温度为65℃。CsXyn11B能够水解多种木聚糖底物,对燕麦木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、榉木木聚糖和桦木木聚糖的比酶活分别为1145.8、1041.7、692.3和653.3 U/mg。该酶水解阿拉伯木聚糖,水解产物以聚合度4~6的低聚木糖为主。在面包制作过程中加入3 mg/kg CsXyn11B使面包比容增加15.9%,面包硬度降低25.3%,4℃贮藏2 d后硬度比对照组降低17%。结论:毛壳霉木聚糖酶B的优良酶学特性使其在烘焙食品中具有良好的应用前景。

低聚木糖-牛乳凝胶的物性及形成机制研究

本文旨在探究低聚木糖-牛乳体系在加热过程中的物性变化和凝胶形成机制。为此,首先通过感官评价方法对低聚木糖-牛乳凝胶的制备条件进行优化。在最优低聚木糖添加量下,研究了低聚木糖-牛乳体系在加热过程中pH、色度、凝胶强度、持水力及流变学参数的变化,并利用溶解度测定、粒径测定及聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析了凝胶形成机制。实验结果显示,低聚木糖-牛乳凝胶在低聚木糖添加量为5%(w/v),加热6 h时获得了最高感官评分。随着加热时间的延长,低聚木糖-牛乳体系的pH降低(8 h时为5.40),凝胶强度升高(8 h为144.4 g),体系在加热2 h后即产生类固体特性(G′>G′′);持水力先增大(加热6 h为53.1%)后降低(8 h为49.1%)。粒径分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,牛乳蛋白在加热后发生聚集。扫描电镜(SEM)结果显示,体系在加热后形成凝胶网络结构。溶解度分析结果表明,离子键是促使蛋白聚集并形成凝胶网络的主要作用力,在不同加热时间样品中的贡献率在46.8%至66.3%之间;疏水相互作用和氢键的贡献较小。随着加热时间的延长,离子键等非共价键的总贡献逐渐减少,这可能与美拉德相关共价键的形成有关。综上,本研究表明低聚木糖可以促进牛乳形成热凝胶,这一特性有望应用于相关产品的研发。

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60 kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对o NP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的:本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)提供基础。方法:从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶(PpBgal42A)基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果:PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适pH和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0~9.5范围内和4~35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31.6%。结论:PpBgal42A是一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,可水解乳糖并合成低聚半乳糖,具有潜在应用价值。

耐冷冻酵母菌的筛选

为从自然界中筛选出耐冷冻酵母菌 ,从土壤、谷物、果蔬、空气等不同来源筛选分离得到 6 0多株酵母菌 ,通过模拟面团预发酵进行耐冷冻酵母菌的初筛选 ,并通过普通面团预发酵进一步筛选 ,得到了 3株耐冷冻酵母菌 ,编号为 FTY2 8,FTY 31和 FTY 5 6。这 3株耐冷冻酵母菌冷冻 7d后存活率和相对发酵力均超过80 ,且海藻糖质量分数大大高于耐冷冻性较差的酵母菌 ,其质量分数最高达 16 .2。

树脂吸附法提取黄芪皂甙

对树脂吸附法提取黄芪皂甙进行了研究 ,通过试验确定了树脂吸附法提取黄芪皂甙的工艺条件。单因素试验结果表明 :综合考虑黄芪皂甙粗品得率和皂甙含量 ,用体积分数为 60的乙醇提取 ,树脂柱长度为55cm ,体积分数为

方便鲜米粉加工技术的研究

本文对方便鲜米粉的加工技术进行了试验研究。为了生产出方便性好的米粉 ,对方便鲜米粉的加工技术进行了探讨。通过大量试验 ,确定了方便鲜米粉的加工方法。

耐热木聚糖酶研究进展

β 1 ,4 内切木聚糖酶 (EC .3 2 1 8)能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖 ,因此是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶具有很大的工业应用潜力和价值 ,由于许多工业应用木聚糖酶的单元操作都是在高温下进行的 ,寻求耐热木聚糖酶作为催化剂是非常重要的。重点介绍了耐热木聚糖酶的特性、分泌表达和结构区域的研究进展。

链霉菌D21产木聚糖酶的发酵条件研究

研究了链霉菌D21产木聚糖酶发酵条件的优化。单因素优化试验结果表明,水不溶玉米芯木聚糖为最佳碳源和诱导物,牛肉蛋白胨为最佳氮源,最适pH值为6.0,最适培养温度40℃。在此条件下,培养4d木聚糖酶活力达到1128U/mL。

利用固定化耐高温木聚糖酶生产木二糖

将重组海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热木聚糖酶B固定于镍螯合环氧载体Eupergit C 250L(固定化XynB)上,水解玉米芯汽爆液连续生产低聚木糖,特别是木二糖。固定化XynB操作稳定性很高,批次水解15次仍保持92%的初始水解活性。90℃下连续水解168h后保持83.6%的初始水解活性,连续操作半衰期为577.6h(24d)。HPLC分析表明,连续水解液中主要含有49.8%木二糖和22.6%木糖。活性碳层析柱可吸附木二糖,利用乙醇梯度洗脱木二糖的收率为84.7%,纯度为97.2%。因此,固定化XynB可用于水解玉米芯汽爆液高效生产木二糖。

嗜热拟青霉木糖苷酶的性质及其与木聚糖酶的协同作用

嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18利用玉米芯能产胞外木糖苷酶,通过(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE-52离子交换层析及Q-琼脂糖凝肢-FF(QSFF)离子交换层析从上清液纯化得到了电泳纯的木糖苷酶,纯化倍数为31.9倍,回收率为2.27%。SDS-PAG E及Superdex-75凝胶过滤层析测定木糖苷酶的分子量分别为53.5 ku和51.8 ku。该酶最适温度及pH分别为55℃和pH 6.5。木糖苷酶能够水解木二糖和低聚木糖但不能水解木聚糖,水解低聚木糖的相对速率随聚合度增加而增加。该酶对木糖的抑制常数Ki值为139 mmol/L,具有很高的木糖耐受性。木糖苷酶与内源木聚糖酶一起水解木聚糖产生更多的还原糖,表现出协同作用。