枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究

【目的】研究比较枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化的最优方法。【方法】以质粒pHCMC04(大小为8089bp)转化突变型枯草芽孢杆菌IA857,分别用电转化法、原生质体法、电击法诱导的原生质体法、Spizizen低盐环境感受态转化法(简称S法)、低盐环境形成饥饿感受态法及其改良方案在其它突变菌株的试验方法(简称C法)进行实验,通过比较优化得出最优转化方法。【结果】采用S法转化枯草芽孢杆菌突变株IA857,质粒加入量为70ng时,转化后直接摇床培养1h转化率最高达到1.2×104 CFU/μg DNA,可以满足枯草芽孢杆菌高效转化的要求。【结论】得出了枯草芽孢杆菌突变株IA857最优转化方法并提出转化枯草芽孢杆菌的基本框架。

环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。

魔芋葡甘露低聚糖的热稳定特性以及与低聚果糖益生元的对比分析

为研究葡甘露低聚糖和低聚果糖热稳定特性,用热重分析仪在不同升温速率下测试两种低聚糖的热稳定性,采用Kissinger法、Kissinger-Akahira-Sunose法和Flynn-Wall-Ozawa法计算得到低聚糖的活化能(E)、指前因子(ln A)、热力学参数以及进行机理函数的判定。结果表明,两种低聚糖的热解过程分为3个阶段,非等温升温速率下的分解峰温在220~300℃。第一阶段是低聚糖干燥脱水的过程;第二阶段低聚果糖的E和ln A均大于葡甘露低聚糖,前者受热解聚生成果二糖和果三糖,迅速结晶化导致E偏高,葡甘露低聚糖机理函数遵循三维扩散和球形对称的Jander方程;第三阶段,葡甘露低聚糖的E和ln A更高,结果表明其热稳定性高于低聚果糖,二者机理函数均遵循随机成核和随后生长的Avrami-Erofeev方程,最后确定低聚糖热解过程热力学参数,即ΔG、ΔH和ΔS。本实验研究葡甘露低聚糖和低聚果糖的热稳定特性,为其应用于食品和医药领域的加工工艺设计提供依据。

大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性

【目的】对大肠杆菌Escherichia coli嗜盐α-淀粉酶基因进行改造,并探索嗜盐α-淀粉酶的嗜盐特性。【方法】从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因k6并进行重组表达。通过同源建模,确定Na+结合位点上的氨基酸残基,并对相应位点进行定点突变。最后对突变酶的酶学性质进行研究。【结果】相对于野生酶,突变酶更加嗜盐,其最适NaCl浓度由2mol/L增加到3mol/L,最适pH值为7,最适温度为50℃,酶活力为4 831U/mg,提高近4倍。经HPLC检测,突变酶与2%(W/V)可溶性淀粉反应后的产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物。【结论】嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性与Na+结合位点具有直接联系。

人工构建微生物组对制革废水的氨氮去除及微生物组的对比变化分析

为探究复合人工微生物组对制革废水处理体系中微生物群落的影响,在传统的厌氧/好氧(A/O)污水处理工艺处理制革废水的基础上,投加微生物复合菌形成人工微生物组。利用复合人工微生物组强化废水处理,应用高通量测序技术测定各样品中的细菌16S rRNA V3-V4变异区序列,并对测序数据进行生物信息学分析、Alpha多样性分析以及物种组成分析。结果表明,投加微生物组后,化学需氧量(COD)和氨氮的处理效果得到提升,COD的去除率约为82.60%,氨氮的去除率约为99.47%。高通量测序结果表明,人工投加微生物组使得活性污泥中微生物群落丰度以及多样性提高,污染物降解功能菌占比有所提升,陶厄氏菌属(Thauera)成为其最主要的优势菌属。复合人工微生物组的投加对强化制革废水处理系统有一定潜力。

麦芽糖淀粉酶CDS 1-3在淀粉糖化过程中的作用分析

为探究多糖相互作用对淀粉糖化速率的影响,本研究使用较传统麦芽糖淀粉酶更具支链淀粉水解能力的麦芽糖淀粉酶CDS 1-3,将其与α-淀粉酶及糖化酶协同进行淀粉糖化,并对糖化液进行还原糖测定以及高效液相色谱分析。结果表明:反应到30 min时,CDS 1-3作用效果最明显,相比于Control组,CDS 1-3组糖化液的葡萄糖当量(Dextrose Equivalent, DE)值提高了4.51%。随着反应的进行,DE值提高速率降低。反应到60 min时,DE值提高了1.17%;反应到90 min时,DE值提高了2.12%。高效液相色谱结果显示,在整个反应过程中,CDS 1-3组葡萄糖和麦芽糖的产量始终高于Control组,说明CDS 1-3可有效加快木薯淀粉糖化速率,可应用于淀粉工业中。

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径suc2基因的敲除及其蔗糖代谢特性的变化分析

蔗糖基生物质是热带和亚热带地区重要的生物质材料,因而在微生物发酵和微生物代谢原料中具有重要的地位。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有以蔗糖为原料进行代谢的能力,在酿酒酵母的基因组中蔗糖水解酶基因共有6个结构基因。本研究以酿酒酵母INVSC1为出发菌株,首先利用基因敲除技术构建suc2基因缺失菌株,然后将suc2基因回补,从而研究suc2基因对酿酒酵母蔗糖关键代谢途径及蔗糖代谢特性的影响。以蔗糖为碳源的发酵培养基中,在静置条件下发酵,suc2基因缺失菌株失去了利用蔗糖代谢的能力,回补菌株则恢复了对蔗糖的代谢;而且回补菌株对蔗糖的利用率及乙醇产量均比出发菌株有所提高。suc2基因是酿酒酵母蔗糖代谢的关键基因,对蔗糖的代谢具有决定性作用,可以作为蔗糖代谢途径改造的一个关键点。

一株产结冷胶的少动鞘氨醇单胞菌的筛选鉴定

为了获得利用蔗糖高产结冷胶的野生菌株,从北海涠洲岛表层土样分离筛选出一株利用蔗糖高产结冷胶的野生菌株,命名为gxas-815。经Biolog生理生化分析和16S r DNA序列分析,鉴定该菌为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。此菌株能以蔗糖为原料发酵生产结冷胶,摇瓶实验表明,在含3%蔗糖、0.3%蛋白胨、0.15%磷酸氢二钾、0.15%硫酸钾、0.25%磷酸二氢钾、0.3%无水硫酸镁的发酵培养基中的结冷胶产量达13.75 g/L,结冷胶每克蔗糖产率达0.458 g,并且能利用糖蜜中除蔗糖外的其他碳源。

阴沟肠杆菌和大肠杆菌的生物化工发酵能力比较研究

本研究通过对Escherichia coli JM109菌株和E.cloacae gxas菌株的碳源利用能力、菌株的生长优势以及胞内发酵产物组成进行了研究。实验结果表明：在碳源利用测试中E.coli JM109结果表现阳性（＋）只有8种,阴性（-）有32种,而E.cloacae gxas阳性（＋）有38种,阴性（-）只有18种,具有广泛的碳源谱。比较2株菌株的生长曲线发现E.cloacae gxas比E.coli JM109生长快,稳定期具有更高的生物量。GC-MS分析结果显示两个菌株的发酵产物的差异极大,在多尺度面上没有重合点。以大肠杆菌为对照菌株,阴沟肠杆菌的发酵产物中有14 776个化合物的产量比大肠杆菌高,只有7 725个化合物的产量比大肠杆菌低。因而,阴沟肠杆菌在生物化工发酵应用中比大肠杆菌更具潜力优势。

基因astE调控微生物抵御丁醇胁迫的生理机制解析

探究敲除精氨酸代谢途径关键酶ast E对大肠杆菌抵御丁醇胁迫能力的影响。借助氨基酸分析仪全面分析ast E基因敲除对细胞内外游离氨基酸水平的变化。同时,通过测定ast E缺失突变株抵御丁醇和酸胁迫的能力,并分析两者之间的联系。研究表明:与对照菌株BW25113相比,突变株△ast E抵御丁醇胁迫和酸胁迫的能力显著提高,分别提高了30%(8 g/L丁醇)和54.5%(p H 3.0)。同时,通过胞内外氨基酸分析发现,高浓度丁醇胁迫可抑制BW25113和△ast E合成谷氨酸的能力,使其浓度分别降低73.6%和89.1%。在此基础上,外源添加精氨酸实验表明:适量精氨酸能有效提高细胞抵御高浓度丁醇胁迫的能力。敲除精氨酸代谢途径关键酶ast E可显著提高大肠杆菌抵御丁醇胁迫的能力,且其调控机制与耐酸胁迫密切相关。

耐受高浓度糖蜜酒精废液的细菌群落的多样性分析

广西的甘蔗糖蜜酒精发酵废液的COD高达100 000 mg/L,同时含有15 000 mg/L的硫酸根离子,属于高盐高浓度有机废水,严重抑制微生物的沼气化过程。为了获得耐受高COD和高硫酸盐的细菌群落的多样性数据,对特异性耐受高浓度糖蜜酒精废液的细菌群落进行分析。提取高浓度糖蜜酒精废液沼气池中淤泥样品的总DNA,应用IIIumina MiSeq高通量测序技术测定各样品中的细菌16S rDNA V3-V4变异区序列,并进行测序数据处理、OTUs聚类及物种注释,分析样品中细菌的复杂度和多样品间细菌组成差异。结果显示:沼气池各样品的优势菌群均是厚壁菌门(Firmicute)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。在废水消化旺盛区域的微生物种群含有泉古菌门(Crenarchaeota)和热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)等与硫酸根降解转化相关的菌株。本研究表明,特异性硫酸根转化菌株的富集揭示了这个细菌群落耐受高硫酸根废液的原因。高通量测序技术为高盐高浓度难降解有机废水沼气池淤泥细菌群落多样性的研究提供了科学有效的数据资源。

重组丙酮丁醇梭菌的构建及其木质纤维素ABE发酵

[目的]提高丙酮丁醇梭菌降解利用纤维素原料的能力.[方法]将甲基化的重组表达载体pSOS95-cel9 电转化至丙酮丁醇梭菌ATCC824.[结果]成功构建重组菌株ATCC824 /pSOS95-cel9.通过荧光定量PCR 检验到外源纤维素酶基因cel9 在重组丙丁梭菌中的转录,24 h 的相对表达量是12 h 的27.1 倍.重组菌ATCC824 /pSOS95-cel9 发酵滤纸产丙酮0.05 g /L、丁醇0.08 g /L、乙醇0.71 g /L,发酵蔗渣水解液产0.78 g /L、1.09 g /L、0.97 g /L,各溶剂产量均显著高于空质粒对照菌株.[结论]重组菌能利用滤纸及蔗渣水解液进行ABE 发酵,外源纤维素酶基因cel9 的重组表达提高了工程菌株利用纤维素原料的能力.