人乳头状瘤病毒18E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮细胞恶性转化的研究

为了研究病毒和促癌物在食管癌形成中的作用，用带有人乳头状瘤病毒１８型Ｅ６Ｅ７片段的载体腺病毒（简称ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７ＡＡＶ）感染人胚食管上皮细胞，然后加ＴＰＡ协同作用，观察细胞转化。将人胚食管切碎，与ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７ＡＡＶ同孵育２小时，在加有１０％小牛血清的１９９培养液培养和传代，形成永生化细胞株，即人胚食管上皮细胞汕头株（ＳＨＥＥ）。实验分两组：一组ＳＨＥＥ细胞在传代至第５和１３代时，两次在培养基中加入ＴＰＡ（１２Ｏｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ１３ａｃｅｔａｔｅ）５ｎｇ／ｍｌ，每次诱导２周，所获得的细胞株称为人胚食管上皮癌细胞汕头株１号（ＳＨＥＥＣ１）；另一组ＳＨＥＥ细胞培养条件相同，未加ＴＰＡ，为对照组。细胞转化的形态表型由光学显微镜、电子显微镜和荧光显微镜检查；ＤＮＡ含量和细胞周期用流式细胞仪检测；用３５ｍｍ软琼脂培养皿接种１０３细胞（第２０代），每组５碟，计算集落形成率；裸鼠皮下接种１０６细胞检测致瘤性；用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）和ＰＣＲ检测ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７。结果表明：细胞ＤＮＡ合成和增殖指数（ＰＩｘ），ＳＨＥＥＣ１组（４５％）高于ＳＨＥＥ组（３４％）；高倍体细胞数，ＳＨＥ?

人乳头状瘤病毒诱导人胚食管上皮永生化细胞恶性转化

为了证实HPV18E6E7基因诱导的人胚食管上皮永生化细胞 (SHEE) 6 1代 (SHEE6 1)部份细胞 (SHEE6 1A)已经恶性转化 ,以寻找监控细胞早期恶性转化的方法。对培养的SHEE第 10代 (SHEE10 )和 6 1代 (SHEE6 1)细胞 ,用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及生长形式 ;用流式细胞仪分析细胞周期 ;用染色体G带核型分析和间期核染色体 1、7、8号着丝粒探针荧光原位杂交 (FISH)检测细胞染色体改变 ;用增殖优势克隆优选法选出生长快的细胞群体 ,接种裸小鼠和SCID小鼠。结果 :光学显微镜下见SHEE6 1细胞大小不等 ,重叠生长 ;电子显微镜下见细胞核多型性和核仁增大等增殖表型 ;流式细胞仪检测 ,SHEE6 1增殖指数和DNA >4n细胞高于SHEE10 ;SHEE6 1细胞染色体众数出现 5 7～ 6 0、6 3～ 6 5两亚群 ,1、7、9、13、17等染色体出现较多 3体、4体或 5体 ;FISH间期核 1、7号着丝粒数增多 ;SHEE6 1克隆优选的细胞SHEE6 1A接种SCID小鼠成瘤。这表明 :SHEE6 1细胞形态及生长特性有了改变 ,接触抑制减弱 ,高倍体和不整倍体细胞增多 ,染色体数目明显改变 ,SHEE6 1A接种SCID小鼠产生浸润性肿瘤 ,可以判定SHEE6 1部份细胞已恶性转化。用克隆优选法筛选和染色体检测可以监控永生化细胞早期恶性转化。

人乳头状瘤病毒诱导食管上皮永生化细胞的双相分化

研究中期永生化食管上皮细胞的表型、细胞遗传学和部份基因的改变 ,以阐明癌前病变的特征。SHEE是该院用人乳头状瘤病毒HPV18E6E7诱导的永生化上皮 ,传至 6 1代已开始有少量细胞恶性转化。对永生化中期 31代培养细胞用相差显微镜检查细胞形态改变和细胞生长状态 (细胞接触抑制和锚定生长 ) ;流式细胞仪检测细胞周期 ;做染色体众数分析 ;多重PCR检查c-myc、p5 3、bcl- 2和ras等基因。免疫组化检查细胞角蛋白和鬼臼毒素荧光标记检查肌动蛋白F(F -actin)。软琼脂培养的集落细胞接种SCID小鼠检查成瘤性。Westernblot方法检测细胞内HPVE6表达蛋白。结果 :培养细胞有两种不同分化形态 ,分化差的基底细胞和分化好的鳞状上皮 ;前者角蛋白和F -actin极少 ,后者含量丰富 ;细胞接触抑制和锚锭生长特性减弱。分析 10 0个细胞染色体众数分二干系 ,5 6条 (占 30 % )和 6 1条 (占 2 4% )染色体 ,核型分析属于超二倍体 ,亚三倍体。多重PCR检查 :c -myc、p5 3基因上调 ,bcl- 2和ras基因阳性。用优选生长在软琼脂上的克隆细胞接种SCID小鼠 ,未成瘤 ;HPV18E6表达蛋白阳性。以HPV18E6E7诱导的食管永生化上皮 31代细胞形态出现了双向分化 ,根据其形态表型 ,双染色体众数的细胞遗传学改变和某些癌基因上调等特性 。

氧化砷诱导食管癌细胞系细胞凋亡的形态学研究

目的在氧化砷（As2O3）作用于食管癌细胞株EC8712过程中，用光镜和电镜观察培养细胞凋亡的形态改变方法ECh712于199培养基常规培养，以3μmolAs2O3作用于细胞，72h收获细胞，作光镜（HE染色，TUNEL标记）、透射电镜和流式细胞仪检查.结果3μmolAs2O3作用72h，出现许多凋亡细胞，培养细胞部分变圆，脱落.在光镜下HE染色观察2种凋亡细胞.一种核小；圆形，致密呈固缩核、和核碎,另一种胞质红染，染色质凝集，二者TUNEL标记阳性．流式细胞仪检测有凋亡峰出现（亚G1／G0峰）．电镜检查有二种凋亡类型.一呈典型凋亡细胞核改变；在早期染色质凝集成块状，细胞器保存完好.第二期，随着染色质改变，细胞核变圆，饱满，核膜完整，染色质靠边，大块染色质，构成车轮状或半月状.核膜变性解体，使染色质逸出．最后细胞变性坏死.凋亡小体易见，小块状球状，膜包或裸露.另一种固缩细胞，细胞皱缩，胞质致密，核电子密度高.结论光镜和电镜检查结果证实As2O3可以诱导食管癌细胞系ECh712细胞凋亡，因此As2O3可作为食管癌辅助治疗药物．

氧化砷诱导食管癌细胞凋亡中一氧化氮的变化

目的一氧化氮 NO 已被认为是生理和病理状态下一种重要生物分子.以氧化砷(As_2O_3)诱导食管癌细胞(SHEEC1)凋亡过程中检测细胞 NO,NO 合成酶(NOS)和一氧化氮合成酶mRNA(NOSmRNA),探索 NO 和细胞凋亡的关系.方法用 As_2O_3(5 μmol·L^(-1)和10μmol·L^(-1))诱导 SHEEC1凋亡,在加药后2,4,8,16,24h 取样检查,用分光光密度法检测细胞培养液的 NO 含量;用免疫组化检测诱导型 NO 合成酶(NOSⅡ);分子原位杂交(ISH)检测 NOSmRNA;实验终点细胞作透射电镜(TEM)检查细胞凋亡.结果在 As_2O_3诱导下,SHEEC1从 NO 基础量(0.68×10^(-2)μmol·L^(-1))逐渐增加,至加药后16h 达最高(2.38×10^(-2)μmol·L^(-1));NOSⅡ在加药后4h～16h 呈阳性反应;NOSmRNA 杂交信号位于胞质,4h 杂交点小而少,以后增加明显.24h,TEM可见 SHEEC1出现细胞凋亡.结论 As_2O_3 可诱导 SHEEC1释放 NO 和细胞凋亡,实验开始至16h NO 量不断增加.NOSⅡ表达和 NOSmRNA 转录上调.提出 NO 可能是 As_2O_3诱导细胞凋亡的介导和作用因子.

人乳头状瘤病毒协同^(60)钴照射促进食管上皮细胞恶性转化

为探明人乳头状瘤病毒(HPV)和促癌剂对食管上皮致癌作用,人胚食管上皮细胞转染HPV协同60钴(60Co)放射观察其恶性转化。用HPV18E6E7AAV转染的人胚食管上皮(SHEE),培养至13代,分为4组,实验组分别用60Co2、4、8Gy照射,每周1次共4周;SHEE未经照射为对照组。细胞形态用相差显微镜观察;细胞DNA合成和定量用3H TdR掺入和用流式细胞仪分析;染色体众数用常规方法分析;致瘤性用软琼脂培养和裸小鼠接种;HPVDNA用PCR检测。经60Co照射后细胞呈凋亡和坏死(危象期)。8周后SHEE4Gy组细胞增殖,增殖指数(34%)和3H TdR摄入增高,软琼脂培养和裸鼠接种出现致瘤性。对照组SHEE组细胞增殖指数24%,伴有少数3H TdR掺入,裸鼠未成瘤。染色体众数:对照组,58～62;4Gy组,63～65;两组HPV18E6E7PCR呈阳性条带。此结果表明,用HPV18E6E7协同60Coγ射线可以使人胚食管上皮恶性转化,60Coγ射线有加速食管上皮细胞恶性转化作用。

食管癌癌旁粘膜的形态观察

110例食管癌手术标本，全层粘膜卷切经组织学检查，食管癌旁粘膜上皮可分四种类型：正常（40％），萎缩（9％），单纯增生（15％），癌前或癌性病变（36％）包括不典型增生，原位癌，度层癌变及早期浸润癌，癌前或癌性病变的位置和范围：80％病变多位于距肿瘤边缘3厘米以内，有2例病变范围达8厘米。越近癌缘，癌前或癌性病变的病灶越多越重，提出癌变上皮继续癌变与主癌的影响有关，食管癌手术切缘最好距主癌3厘米地上。

NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究

为研究NGAL (neutrophilgelatinase associatedlipocalin)基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中的表达情况 ,以永生化食管上皮细胞系SHEE和食管癌细胞系SHEEC互为对照 ,用cDNA微列阵进行筛选 ,用RNA印迹和RT PCR进行鉴定 ,cDNA克隆测序后与GenBank进行BLAST分析比较 .结果表明NGAL基因在SHEEC中出现显著差异过表达 ,其cDNA序列与小鼠 2 4p3、大鼠NRL (neu relatedlipocalin)、人中性粒细胞NGAL和卵巢癌NGAL具有较高的相似性 .这提示NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用 。

肿瘤光动力疗法诱导细胞凋亡机制研究进展

肿瘤光动力疗法 (PhotodynamicTherapy ,PDT)是利用光敏剂分子接受光照后产生多种活性氧物质 (reactiveoxygenspecies ,ROS) ,使细胞结构和功能受到损伤 ,而导致细胞凋亡的一种独特的肿瘤治疗方法 ,已受到越来越多的重视。

DMSO和As_2O_3对人食管癌细胞增殖的抑制作用

目的 抑制肿瘤细胞生长是治疗肿瘤的重要基础。本文比较二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）和维甲酸对人食管癌细胞生长抑制的影响。方法 用生长曲线、剂量－效应曲线、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入、ＭＴＴ比色分析、细胞周期的流式术检测、ＰＣＮＡ及Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１免疫组化等多项指标反映细胞增殖改变。结果 二甲基亚砜和三氧化二砷对食管癌细胞株生长的抑制作用较传统的维甲酸效果更强。结论

Fascin 1基因在永生化食管上皮细胞癌变中的表达

背景与目的:Fascin1蛋白为一种与F-肌动蛋白结合的55kDa细胞骨架蛋白,从人畸胎瘤中克隆fascin1基因。食管上皮细胞癌变机制至今不甚明了,为此,对永生化食管上皮细胞株SHEE(Shantouhumanembryonicesophagealepithelialcellline)和由SHEE恶性转化而来的食管癌细胞株SHEEmt之间的差异表达基因在蛋白质和mRNA两个水平上进行检测分析,以期为揭示食管鳞状上皮细胞癌变机制提供新思路。方法:采用双向凝胶电泳技术分析SHEE与SHEEmt之间的蛋白质差异表达情况,以基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflyingmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)对部分差异表达蛋白质点进行鉴定,以逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionploymerasechainreaction,RT-PCR)对目标基因进行mRNA转录水平上的检测,并对RT-PCR产物进行序列测定分析。结果:在SHEE向SHEEmt的恶性转化中有9个基因出现差异表达,其中fascin1基因在蛋白质水平升高3.64倍,mRNA水平升高16.17倍。结论:fascin1基因可能与SHEE向SHEEmt的恶性转化有关。

番茄红素体外对人食管癌细胞SHEEC36的初探

目的 探讨番茄红素对体外培养的人食管癌细胞的影响。方法 应用MTT法和流式细胞术手段 ,观察不同剂量的番茄红素对体外培养的人胚食管上皮癌细胞汕头株36代 (SHEEC36 )的增殖抑制及诱导凋亡作用。结果 MTT实验显示 ,番茄红素体外对SHEEC36细胞增殖有明显的抑制作用。结论 番茄红素体外能抑制SHEEC36增殖。

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5'-UTR和3'-UTR的克隆与鉴定

背景与目的:NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)基因是lipocalin家族的一个新成员。以往我们曾研究发现NGAL基因在TPA诱导永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEC恶性转化的过程中显著过表达,但表达调控机制不清楚。本研究拟从SHEEC细胞中克隆NGAL基因的5'-UTR和3'-UTR(untranslatedregion)并进一步明确其结构特征。方法:采用RACE方法从SHEEC细胞中克隆NGAL基因的5'-UTR和3'-UTR;在测序基础上进行BLAST分析鉴定。结果:结合以往的实验结果,从SHEEC细胞中克隆了NGAL基因的69bp5'-UTR和147bp3'-UTR,而且序列分析未发现突变。结论:SHEEC细胞中的NGAL基因具备完整的5'-UTR和3'-UTR结构。

反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架的影响

为了研究反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架以及肿瘤细胞生物学行为的影响 ,以不同长度NGAL基因片段反义表达载体和硫代修饰反义寡核苷酸单链片段转染SHEEC食管癌细胞 ,通过G4 18筛选 ,建立一系列旨在封闭SHEEC食管癌细胞NGAL基因表达的亚细胞克隆 .在细胞内F 肌动蛋白 (F actin)及DNA荧光双标记基础上 ,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜扫描术等技术手段检测封闭反义NGAL基因表达后 ,SHEEC食管癌细胞中F actin和DNA含量、F actin形态结构以及肿瘤细胞生物学行为的变化特征 .结果显示 ,反义封闭NGAL基因表达后 ,SHEEC食管癌细胞F actin的含量明显降低 ,与永生化食管上皮细胞SHEE相近 ,但细胞分裂增殖指数未见明显变化 .表明反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架有明显影响 ,而对SHEEC食管癌细胞的分裂增殖影响不明显 .激光共聚焦显微镜扫描观测显示 ,反义封闭NGAL基因表达可使SHEEC食管癌细胞F actin分布均匀 ,F actin小体减少 ,细胞间连接重新建立 ,结构较紧密 ,主要形态结构特征与SHEE细胞趋于一致 .提示反义封闭NGAL基因表达可对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架F actin产生明显影响 ,推测癌细胞的微丝骨架F

番茄红素对亚硝胺诱发大鼠食管癌预防效果的实验研究

目的 研究番茄红素对大鼠食管癌的预防效果。方法 选用 Wistar大鼠 ,分为三组(单亚组和实验组各 50只、空白组 30只 ) ,实验组大鼠开始即喂饲番茄酱 ,持续至实验结束 ,二周后单亚组及实验组同时开始肌注甲基戊基亚硝胺 ( MANA) ,5mg/kg,每周 1次 ,持续 2 0周。分 5次处死动物。结果 单亚组和实验组大鼠食管均发生癌前病变 ,两组癌前病变的发生率有差异。

不同剂量三氧化二砷对食管癌细胞的作用

目的 :研究不同浓度As2 O3对食管癌细胞系的作用。方法 :食管恶性转化上皮细胞 (SHEEC1)是我室用人乳头状瘤病毒 (HPV) 18和TPA诱发的细胞系 ,培养在培养瓶和 2 4孔板 ,用浓度 1,3和 5 μmol/L的As2 O3处理 2 ,4 ,8,16,2 4h ,电镜检查细胞形态 ,光镜检查核分裂指数 (MI) ;用放射自显影检查 [3H] TdR掺入细胞 ;流式细胞仪检查增殖指数 (PI)和凋亡指数 (AI)。结果 :低剂量As2 O3( 1.0 μmol/L)组 [3H] TdR掺入细胞 ,MI,PI皆增加 ,提示SHEEC1增殖率提高 ;高剂量组 ( 3和 5 μmol/L)高AI和低PI,给药 2 4h后 ,电镜可见细胞凋亡和坏死。结论 :不同剂量氧化砷的作用不同 ,低剂量可引起食管癌细胞DNA合成增加和促进细胞增殖 ,高剂量则引起细胞凋亡和坏死。

新候选癌基因STRBP8在人永生化食管上皮细胞癌变过程中差异表达的分析

背景与目的:近年来,核基质蛋白(nuclearmatrixproteins,NMPs)成分、结构与功能改变在肿瘤发生发展过程中的作用已成为人们研究的热点问题。分离并鉴定肿瘤相关的NMPs,是寻找肿瘤特异性标志物并进一步研究肿瘤发病机制的一个新途径。本研究通过检测类视网膜母细胞瘤结合蛋白8(similartoretinoblastomabindingprotein8,STRBP8)在人永生化食管上皮细胞癌变过程中的差异表达,为寻找食管癌特异性标志物和研究食管癌的发病机制提供新线索。方法:硫酸铵沉淀法提取人胚永生化食管上皮细胞系SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞系SHEEC的NMPs,利用双向电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI鄄TOF鄄MS)和RT鄄PCR等技术检测STRBP8在SHEE和SHEEC中的差异表达。将STRBP8cDNA序列连接到pGEM鄄Teasy载体后,转化TOP10F蒺大肠杆菌感受态细胞,经筛选获得含STRBP8的阳性克隆,DNA序列测定后进行BLAST比对。结果:通过双向电泳和MALDI鄄TOF鄄MS技术分离并鉴定出核基质蛋白STRBP8只在SHEEC中表达,RT鄄PCR分析发现STRBP8mRNA也只出现在SHEEC细胞中。将其cDNA序列插入pGEM鄄Teasy载体后,经转化和筛选获得含STRBP8的阳性克隆。测序结果显示克隆得到的STRBP8cDNA片段与Genbank数据库上的序列完全一致。结论:STRBP8作为一种新?

HER2表达与食管癌患者生存期的关系

目的：HER2（human EGF receptor type 2）在食管癌中的过表达是否与食管癌患者生存期缩短相关,存在着两种不同的观点。为此,我们在大样本回顾性调查基础上,做进一步的研究,为弄清两者是否相关提供有用的数据资料。方法：在收集1988~1997年间的341例食管癌病例进行回顾性调查的基础上,通过联合应用组织芯片和免疫组织化学等实验方法检测食管癌组织中HER2的表达,分析HER2表达与食管癌患者生存期之间的相关性。结果：与正常食管上皮组织相比,HER2在多数食管癌组织中过表达;HER2过表达与食管癌组织细胞的分化程度相关（P〈0.05）;但与食管癌患者生存期缩短相关性不明显（P〉0.05）。结论：按FDA判定标准,食管癌组织细胞中HER2蛋白的过表达不是判定食管癌患者生存期缩短的有效指标。