BMMYA'平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶

摘建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法。该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA'平板-FastblueRR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2%甲醇的BMMYA'平板上,30℃生长并诱导4～5 d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1 h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂。2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90%。

港口机械液压系统的主动维护

为确保港口机械设备液压系统的良好工作状态,主动维护可为其提供创建港口机械设备液压系统主动维护的指标体系,明确港口机械设备液压系统用液压油的主动维护环节,主动检验港口机械设备液压系统密封性工作,优化港口机械液压系统滤材的更换周期。

港口液压设备运行中污染控制技术

研究了港口液压设备的故障种类,分析港口液压设备污染与故障之间的关系,提供了建立港口液压设备清洁保养技术规范,严格执行港口液压设备油品加注程序,建立主动港口液压设备污染控制的对策,做好港口液压设备滤材滤芯的更换工作,强化港口液压设备的密闭密封环节等措施和方法,为港口企业更好地应用技术手段控制液压设备污染做出了深层次思考。

以模块化管理为基础 构建基层党风廉政建设体系

基层党风廉政建设是国有企业党建的重要内容,是全面从严治党引向深入的重要途径。但基层问题复杂,基层的党风廉政建设工作就必然面临很多新课题。本文通过对1+1+N”模块化管理的探索和实践,以期找到企业纪检监督工作创新发展的方向,进一步助推企业“健康、协调、稳定”发展。

高温酶的生化性质及其基因工程的新技术

以酶的催化反应代替工业加工中化学处理过程,是保护环境、实现可持续发展的重要策略。工业酶的开发应用所面临的最大障碍是酶的生产和应用成本问题;降低工业酶的生产和应用成本主要有以下途径:(1)选取在应用条件下单位活性高的酶;(2)采用催化功能更为持久的酶;(3)通过基因工程尽可能提高酶的产率。极端嗜热或超嗜热微生物能够产生高温酶,甚至产生最适反应温度超过80℃的超高温酶。在工业加工或生化工程中运用这些酶进行高温下的催化反应,能够收到以下有益效果:提高反应底物的溶解度、降低反应液黏度、避免杂菌污染、通常有更高的反应速度,并且催化活性能够持久不衰。但是高活性的高温酶产量很低,即使通过基因重组技术,具有重要工业应用价值的关键酶的产量也难以提升。本文对高温酶的基因工程技术,以及适用于纸浆漂白的超高温酶的应用潜力进行综述,为促进现代酶工程的发展提供帮助。

定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力

运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。

D190V点突变提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCCM 201021脂肪酶的最适温度和热稳定性

【目的】对来源于Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶进行了D190V定点突变,提高该酶的最适温度和热稳定性。【方法】对毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL进行酶学性质比较。【结果】D190V的最适温度比r27RCL高5°C,65°C下的半衰期提高了一倍,在其他性质方面,突变酶D190V与r27RCL基本相似。【结论】通过结构分析表明,定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。

大肠杆菌热休克或冷休克启动子调控的基因表达载体

基因重组技术已经成为获得各种酶和生物活性蛋白的主要手段。虽然很多基因已在大肠杆菌中得到高效表达,但是当人们认定某种蛋白对科学研究或生产应用极为重要时,却常常因为其基因表达水平很低或产生包涵体而感到束手无策。表达载体pHsh和pEXC通过激活热休克或冷休克转录调控机制提高分子伴侣的表达水平,从而降低目标蛋白的细胞毒性并减少包涵体形成。应用于生物合成、分子修饰或生物降解的高温酶可以通过pHsh系统表达获得高产,而科研和诊疗所需要的来源于动植物和常温微生物的基因可以通过pEXC系统获得高效表达。这些新载体的发展为重组蛋白的小规模制备和大规模生产提供了新策略和有效途径。

基因拷贝数和甲醇浓度对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的影响

将华根霉脂肪酶基因克隆到甲基营养型毕赤酵母中表达,以甲醇利用快型菌株为宿主,在7 L发酵罐水平对脂肪酶基因拷贝数分别为3、5、6的3株基因重组菌——XY RCL-3、XY RCL-5、XY RCL-6进行高密度发酵调控,同时研究了甲醇浓度对表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,XY RCL-5在相同条件下发酵产酶能力高于XY RCL-6和XY RCL-3,最适甲醇诱导浓度控制在0.1%±0.02%时,酶活可达到12 500 U/mL,菌体干重达到204 g/L,蛋白浓度也能达到8.02 g/L。

共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶发酵过程的影响

【目的】通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达。【方法】利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法,在7 L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异。【结果】在相同条件下,BH128发酵产酶能力高于H238,最高酶活可达到2 338.7 U/mL,最大比生长速率达到0.02 h 1,最大产物比形成速率达到944.5 U/(gDCW.h),最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW.h),分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍,且发酵周期缩短了20 h。【结论】毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI,提高了米根霉脂肪酶的产量,而且缩短了发酵周期,为工业化生产奠定了基础。