假两性畸型小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶mRNA的异常表达

为了解假两性畸型（Ｔｆｍ）小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶（Ｐ４５０ｓｃｃ）ｍＲＮＡ的水平及影响其转录的机理，用反转录－多聚酶链反应比较了５ｄ、２０ｄ、２５ｄ和３０ｄ正常小鼠、Ｔｆｍ小鼠及３０ｄ手术隐睾小鼠睾丸Ｐ４５０ｓｃｃ的ｍＲＮＡ水平，正常小鼠在５～２０ｄ时，Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ水平较低，从２５ｄ起明显增高，至３０ｄ时ｍＲＮＡ水平是５ｄ时的７５倍；Ｔｆｍ小鼠在５ｄ时，Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ水平稍高于正常小鼠，但随后直至３０ｄ其水平未见明显增高，在３０ｄ时，Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ总量低于正常小鼠１／１０；３０ｄ手术隐睾小鼠的Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ水平低于正常３０ｄ小鼠１／２，高于Ｔｆｍ小鼠５倍。结果提示，２５ｄ的Ｌｅｙｄｉｇ细胞功能的形成需要受体介导的雄激素作用，而Ｔｆｍ小鼠由于编码雄激素受体基因突变，间接导致青春期Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ的低水平。

小鼠睾丸雄激素受体mRNA与17α-羟化酶mRNA相关性研究

为了进一步揭示雄激素与17α-羟化酶的关系，本研究应用反转录-多聚酶链式反应的方法测定了正常小鼠、Tfm小鼠和手术隐睾小鼠睾丸中雄激素受体mRNA水平和17α-羟化酶mRNA的水平。结果显示：1．小鼠睾丸在发育过程中雄激素受体mRNA水平和17α-羟化酶mRNA的水平增加成正相关；2．Tfm小鼠睾丸中雄激素受体mRNA水平和17α-羟化酶mRNA水平均明显降低；3．手术隐睾小鼠睾丸，虽然雄激素含量下降，但雄激素受体mRNA水平及17α-羟化酶的mRNA水平均正常。结果提示了雄激素对17α-经化酶的调节作用。

人精子表面ConA受体在顶体反应中的改变

运用胶体金标记的ConA 为分子探针,观察人精子表面ConA 受体在顶体反应中的改变。结果表明:1.人精子表面ConA 受体被一些大分子物质所掩盖,孵育前不被显示。2.孵育后人精子顶体后区质膜集聚ConA 受体,提示该区ConA 受体在精子与卵子识别的过程中起重要作用。

无精子症和严重少精子症DYS240基因位点的分析

无精子因子（AZF）的缺失将导致无精子症和严重少精子症。本研究应用PCR方法分析了65倒核型正常的无精子症和25例核型正常的严重少精子症病人的DYS240基因位点。结果显示，无精子症病人中6例缺失DYS240基因位点，严重少精子症病人中4例缺失DYS240基因位点。提示DYS240基因是AZF的一个重要的候选成分。

半定量PCR比较正常小鼠和Tfm小鼠Leydig细胞17α－羟化酶mRNA的水平

本研究运用反转录合成ｃＤＮＡ和半定量ＰＣＲ的方法，测定了正常小鼠和Ｔｆｍ小鼠Ｌｅｙｄｉｇ细胞中１７α－羟化酶ｍＲＮＡ／β－肌动蛋白ｍＲＮＡ的比值，以比较二者睾丸Ｌｅｙｄｉｇ细胞中１７α－羟化酶ｍＲＮＡ的水平。结果显示：１．正常小鼠Ｌｅｙｄｉｇ细胞的１７α－羟化酶和β－肌动蛋白ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增指数期均在２８个循环时完成，Ｔｆｍ小鼠的β－肌动蛋白ｃＤ－ＮＡ的ＰＣＲ扩增指数期在２８个循环完成，而１７α－羟化酶ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增指数期直至３２个循环仍没完成；２．在指数期时，正常小鼠Ｌｅｇｄｉｇ细胞中１７α－羟化酶ｃＤＮＡ／β－肌动蛋白ｃＤＮＡ为４．２８±０．８８，Ｔｆｍ小鼠为０．０７９±０．０４；正常小鼠１７α－羟化酶ｍＲＮＡ的水平高于Ｔｆｍ小鼠５４．１８倍。结果进一步证实Ｔｆｍ小鼠Ｌｅｙｄｉｇ细胞１７α－羟化酶ｍＲＮＡ水平低下是导致该酶活性降低的根本原因。

锌对小鼠精子表面Con A受体及顶体蛋白酶活性影响的组化观察

1978年和1981年Aonuma曾分别报道了2.5×10-4M浓度的ZnCl2能抑制小鼠附睾尾部的精子在体外的的获能过程和穿透卵子的能力,但其机理有待阐明,本实验采用小鼠附睾尾部精子,分别经去Ca-BWW和加有2.5×10-4M ZnCl2的去Ca-BWW获能孵育液经37℃25小时孵育后,接上经胶体金标记的Con A。

人精子有效抗原基因表达克隆的研究

我们从人睾丸组织中提取ＲＮＡ，并进一步纯化出ｍＲＮＡ；以此为模板，在反转录酶和ＤＮＡ多聚酶的作用下，合成ｃＤＮＡ；将ｃＤＮＡ与λｇＩＩ载体重组后转染大肠杆菌，构建人睾丸ｃＤＮＡ表达文库。运用遗传显色法和噬菌斑原位杂交法鉴定表达文库后，用兔抗人精子抗体筛选人精子抗原基因表达克隆（ＨＳＧ）。对ＨＳＧ表达抗原（ＨＳＧＡｇ）和特异抗体（ＨＳＧＡｂ）进行纯化和抗生育效应的测定。结果显示：（１）人睾丸ｃＤＮＡ表达文库容量为１．８２Ｘｌ０６ｐｆｕ，遗传显色法示重组率为６７％，噬菌斑原位杂交法示重组率为５１％。（２）经兔抗人精子抗体筛选２Ｘｌ０４ｐｆｕ，得８株人精子抗原基因表达克隆。（３）人血清、兔血清ＨＳＧ２Ａｂ和兔血清ＨＳＧ８Ａｂ对人精子具有补体依赖细胞毒作用。（４）兔血清ＨＳＧ３Ａｂ能阻断人精子在顶体反应时顶体后区ＣｏｎＡ受体的暴露。结果提示，ＨＳＧ２、ＨＳＧ３和ＨＳＧ８克隆的表达抗原是精子有效抗原，能作为精子免疫避孕疫苗的候选成分。

反转录－多聚酶链反应扩增小鼠睾丸17α－羟化酶mRNA

１７α－羟化酶催化雄激素合成的中间步骤，它对了解睾丸间质细胞内雄激素的合成具有重要的意义。本研究首先提取小鼠睾丸组织ＲＮＡ，然后以１７α－轻化酶ＤＮＡ两端的特定序列为引物，反转录合成ｃＤＮＡ，再以ｃＤＮＡ为模板行ＰＣＲ扩增ｃＤＮＡ。结果显示，反转录ＰＣＲ后获得一条３６０ｂｐ的电泳带，为１７α－羟化酶ｃＤＮＡ。结果表明，用反转录ＰＣＲ方法扩增睾丸１７α－羟化酶ｍＲＮＡ是切实可行的。

小鼠睾丸间质细胞部分雄激素生成酶mRNA的扩增

小鼠睾丸间质细胞部分雄激素生成酶ｍＲＮＡ的扩增沙家豪周作民王黎熔林敏胡志刚Ｐ．Ｊ．Ｏ＇Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ本研究应用不连续密度梯度离心纯化小鼠睾丸间质细胞（Ｌｅｙｄｉｇ细胞），并运用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法扩增所分离的Ｌｅｙｄｉｇ...

小鼠 Ⅲ 型 17β-羟甾脱氢酶的序列及其表达

１７β－羟甾脱氢酶（１７β－ＨＳＤ）催化１７－酮类固醇与１７β－羟类固醇相互转换。本研究从小鼠睾丸中纯化出小鼠Ⅲ型１７β－ＨＳＤ的ｃＤＮＡ克隆，最长的ｃＤＮＡ核苷酸数为１１３１，包含一个短的５′非编码序列、９１８个核苷酸编码序列和１５５个核苷酸３′非编码序列；其起始密码子为ＡＴＧ，终止密码子为ＴＡＧ，开读框架编码为３０５个氨基酸的多肽。该研究为进一步了解１７β－ＨＳＤ的缺乏和性激素代谢的分子机理奠定了基础。

Ⅰ型和Ⅲ型17β-羟甾脱氢酶在小鼠睾丸发生过程中的表达

17β-羟甾脱氢酶（17β-HSD）催化雄甾烯二酮转化成睾酮，已知Ⅰ型和Ⅲ型17β－HSD为催化还原反应的同功酶，本研究测定了小鼠胚胎期和出生后这二种还原型同功酶的mRNA水平。在胚胎期和刚出生的睾丸，Ⅰ型和Ⅲ型同功酶的mRNA均为高表达，出生后第5天为峰值，而后，二者的表达明显降低并持续到出生第30天，第30天起，Ⅲ型同功酶的表达明显增高。结果提示：在缺乏Ⅲ型同功酶而致的男性假二性畸型中，胚胎期Ⅰ型17β－HSD的表达可能与Wolffian管的分化有关。

hCG对成年小鼠睾丸Leydig细胞中睾酮生成酶的调节作用

目的 从分子水平探讨 h CG对成年小鼠睾丸 L eydig细胞中胆固醇侧链裂解酶 (P45 0 scc)、17α-羟化酶 (P45 0 c17)和 3β-羟甾脱氢酶 (3βHSD)的调节作用。 方法 体外培养成年小鼠睾丸 L eydig细胞 ,分别测定培养1、8h h CG刺激组及对照组细胞培养上清中睾酮含量 ,同时运用半定量 RT- PCR及核酸内切酶酶切方法测定两组细胞中 P45 0 scc、P45 0 c17及 I、VI两型总的 3βHSD的 m RNA水平 ,并测定了 I、VI两型 3βHSD m RNA的比值。 结果 1.培养 1、8h刺激组睾酮含量均明显高于对照组 (1h P<0 .0 1,8h P<0 .0 0 5 ) ;2 .培养 8h,刺激组 P45 0 scc和P45 0 c17m RNA水平明显高于对照组 (P<0 .0 5 ) ;而培养 1、8h刺激组 I、VI两型总的 3βHSD m RNA水平和对照组相比均无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但 VI型 3βHSD m RNA和 I型 3βHSD m RNA的比值逐渐增高。 结论 h CG能在转录水平刺激 P45 0 scc、P45 0 c17及 VI型 3βHSD的表达 ,促进睾酮生成。

双向凝胶电泳和质谱技术在睾丸蛋白表达研究中的应用

目的 :探讨双向凝胶电泳和质谱技术在睾丸蛋白表达研究中的应用。 方法 :用双向凝胶电泳分离成年雄性ICR小鼠睾丸总蛋白 ;从胶上切下 2个蛋白点 ,经胶内原位酶解后 ,用质谱仪测得其肽质量指纹谱 ;再通过数据库检索鉴定蛋白质。 结果 :从胶上切下的 2个蛋白点数据库检索结果是小鼠血清白蛋白和蛋白质二硫化物异构酶。 结论 :用双向凝胶电泳分离睾丸蛋白样品取得了很高的分辨率 ,质谱技术鉴定蛋白快速方便 。

类固醇生成因子-1对青春期小鼠睾丸中睾酮生成及精子发生的调节

目的 探讨类固醇生成因子 1(SF 1)对青春期小鼠睾丸内分泌功能及精子发生过程的调节作用 ,并推测其可能机制。 方法 用免疫组织化学方法定位SF 1在不同年龄小鼠睾丸中的细胞分布 ,进一步分离有SF 1阳性表达信号的青春期小鼠Leydig细胞在体外进行培养 ,用反义转染方法抑制细胞内SF 1蛋白质的表达 ,检测细胞的睾酮分泌量及睾酮生成酶P4 5 0scc的mRNA水平变化。 结果 1 SF 1在青春期Leydig细胞核有表达 ;反义抑制细胞内SF 1蛋白质的表达 ,则细胞的睾酮分泌量及P4 5 0sccmRNA水平均显著下降 ;2 SF 1在青春期小鼠睾丸B型精原细胞及细线期、偶线期、粗线期的初级精母细胞核中也有表达。 结论 1 SF 1参与调节青春期睾丸Leydig细胞中P4 5 0scc基因的转录 ,影响睾酮分泌 ;2 SF 1作为一种核受体 ,可能也是生精过程中重要的转录调控因子 ,调节B型精原细胞向初级精母细胞分化及初级精母细胞第 1次减数分裂过程中特异表达的基因转录过程 ,从而影响青春期小鼠精子发生过程。

小鼠卵巢蛋白质双向凝胶电泳蛋白谱系的初步建立及其功能分析

目的：初步建立性成熟小鼠卵巢蛋白质图谱，并对其中的蛋白质功能进行研究。方法：通过双向电泳和质谱技术分析性成熟小鼠卵巢蛋白质组，并对其中的一种蛋白质进行免疫组化研究。结果：(1)获得高重复性和高分辨率小鼠卵巢蛋白图谱。软件分析显示，3个不同卵巢样品24cm 银染蛋白凝胶上的蛋白点均有±2000点，胶重复性好，大部分蛋白点位于相对相同的位置。(2)质谱共鉴定出52种蛋白质，按功能对其进行分类：参与细胞代谢、细胞信号传导/交流、细胞结构/运动、细胞/器官防御与抗氧化作用、调节 RNA 合成、调节蛋白表达及未分类。(3)通过对其中的一种蛋白(GRP78)行免疫组化分析，发现随着卵巢由卵泡早期逐渐生长到排卵前卵泡期成熟并转向黄体期，其在颗粒细胞中的表达信号增强。结论：(1)3个不同卵巢样品蛋白质双向电泳图重复性好。我们通过质谱分析共鉴定出约52种蛋白质，初步构建了小鼠卵巢双向电泳蛋白图谱，对研究卵巢病理与生理、发育过程有着重要的参考价值。(2)行免疫组化分析结果显示，在卵巢周期变化过程中，GRP78蛋白对颗粒细胞的增生、分化、形成黄体颗粒细胞起着重要的调控作用。

男性特发性不育症与DAZ基因关系的探讨

目的 探讨特发性无精子症和严重少精子症与DAZ基因的关系及意义。方法 应用PCR技术对 5 0例无精子症和严重少精子症患者 (其中无精子症 38例 ,严重少精子症12例 )的外周血细胞进行DAZ基因检测。结果 5 0例中发现 6例 (12 % )有DAZ基因微缺失 (其中无精子症 4例 ,占8% ;严重少精子症 2例 ,占 4 % ) ;SRY基因PCR扩增均为阳性。 5 0例已有生育的正常男性均无DAZ及SRY的微缺失。结论 DAZ为无精子因子 (AZF)的重要候选成分 ,DAZ微缺失可能是引起无精子和严重少精子并造成男性不育的重要原因之一。

聚精丸治疗少精子症的实验研究

目的：观察聚精丸对少精子症患者精子超微结构和生精细胞凋亡的影响，探讨聚精丸对精子生成的作用机制。方法：50例少精子症患者口服聚精丸5g／次，3次／d，3个月为1个疗程，连续服用1—4个疗程，分别于治疗前、治疗1、3、6、12个月后，通过透射电镜和流式细胞仪（FCM）观察精子超微结构和生精细胞的凋亡、生精细胞倍体比例的变化。结果：①精子超微结构治疗6个月后顶体基质密度有所增加，治疗12个月后顶体膜形态完整性有明显改善；核的病理改变和尾部异常改变不明显。②生精细胞凋亡治疗后细胞碎片和凋亡细胞减少，治疗3个月后与治疗前比较差异有显著性（P〈0．05），治疗12个月后与治疗前比较差异有极显著性（P〈0．01）。⑧生精细胞倍体比例经聚精丸治疗3个月后，单倍体成熟精子增多，与治疗前比较差异有极显著性（P〈0．01）；脱落的精母细胞减少，与治疗前比较差异有显著性（P〈0．05）。结论：聚精丸可改善少精子症患者精子顶体基质密度和顶体膜结构形态的病理性改变，提高顶体膜和顶体酶的质量；降低生精细胞及精子凋亡速率，提高单倍体精子的百分率，降低二倍体细胞的百分率。

人精子抗原基因－2表达产物相关抗体对精子运动的影响

在构建成人睾丸ｃＤＮＡ文库的基础上，用兔抗人精子抗体自文库中筛选出了８株阳性克隆，并对其中的ＨＳＧ２表达产物进行理化特性测定和抗ＨＳＧ２表达产物抗体的生物学活性测定。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示溶原蛋白的分子量约为１５５ＫＤａ。抗ＨＳＧ２表达产物抗体能明显的抑制精子的运动能力，对精子凝聚、顶体蛋白酶和精子表面的ＣｏｎＡ受体无影响。提示ＨＳＧ２表达产物可能成为精子疫苗的候选成份。

精子发生相关基因DYS1的分析

用ＰＣＲ方法检测了核型正常（４６，ＸＹ）的９５例无精子症患者和３５例严重少精子症患者基因组ＤＮＡ中的ＤＹＳ１，发现４例无精子症患者有ＤＹＳ１的丢失，严重少精子患者中发现３例有ＤＹＳ１的丢失。结果表明：应用ＰＣＲ法检测ＤＹＳ１基因片段是切实可行的，对无精子症和严重少精子症患者的病因诊断具有一定的应用价值。

DAZ及DAZH基因与精子发生的相关性分析

ＤＡＺ基因（ｄｅｌｅｔｅｄｉｎａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ）是无精子因子（ＡＺＦ）的重要候选成分，它的缺失可致无精子或严重少精子症。人第３号染色体上存在着ＤＡＺ的同源基因ＤＡＺＨ（ＤＡＺｈｏｍｏｌｏｇｕｅ），为探讨ＤＡＺ和ＤＡＺＨ基因在精子发生中的作用，我们用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了６６名正常生育男性和９０例原发性不育男性基因组ＤＮＡ的ＤＡＺ、ＤＡＺＨ基因。结果：原发性不育男性中１２例ＤＡＺ缺失（无精子症８例，严重少精子症４例）；正常男性ＤＡＺ无一缺失；在正常男性和不育男性中均有ＤＡＺＨ缺失。结果进一步证实ＤＡＺ为ＡＺＦ的候选成分，而ＤＡＺＨ基因与精子发生似无直接的相关性。