髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。Spi1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。结论成功构建和鉴定髓系特异性Spi1 KO小鼠,为进一步揭示PU.1在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Western blot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠基因稳定遗传。与Spi1^(flox/flox)小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。

基于Cre/Loxp系统的Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠的构建及效率检测

目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Western blot分析EYFP对不同组织以及不同组织CD45^(+)细胞中CSF1R的标记效率。结果获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠。此外,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP可有效标记小鼠组织CSF1R以及不同部位中CD45^(+)细胞。与R26R^(EYFP)组比较,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP标记效率最高的是脑组织(P<0.001),最低的是胸腺组织(P<0.05),脾脏组织则差异无统计学意义。结论成年Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠是获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)诱导型条件性荧光小鼠的有效途径。Csf1r-Cre^(ERT2)介导EYFP可对小鼠不同部位CSF1R以及CD45^(+)细胞中CSF1R进行有效示踪。

一种靶向HER2嵌合抗原受体CAR THP-1细胞系的构建

目的获得稳定转染靶向人类表皮生长因子2(HER2)的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)。方法构建靶向HER2的CAR慢病毒载体并感染人单核细胞白血病细胞系(THP-1)。通过分选流式细胞仪分选出含有绿色荧光标记的CAR THP-1细胞并在体外继续培养。将此靶向HER2的CAR THP-1细胞与HER2表达阴性(-)及阳性(+)的子宫内膜癌细胞系Ishikawa分别共培养,通过成像流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬,通过流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬比例。结果CAR慢病毒感染THP-1细胞效率较低;与癌细胞共培养后,流式细胞术及成像流式细胞术结果显示,CAR THP-1组与空载体组相比,CAR THP-1细胞对HER2阳性的Ishikawa细胞吞噬能力增强(P<0.01)。结论通过构建CAR慢病毒载体并转染THP-1细胞,成功建立了靶向HER2的CAR THP-1细胞系,且其能通过特异性靶向吞噬HER2阳性Ishikawa细胞。

类风湿关节炎患者血管紧张素Ⅱ水平与临床炎症指标相关性研究及ARBs类药物的治疗作用

目的探究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平与类风湿关节炎患者临床指标相关性并明确血管紧张素受体拮抗剂(ARBs)对RA患者的治疗作用。方法收集2019年至2021年来我院就诊的RA患者血浆标本和个人信息,用ELISA检测人群血浆中AngⅡ水平,阐明血浆中AngⅡ水平与RA患者病情严重程度的相关性。通过病理学检查方法以及流式细胞术,明确RA患者滑膜组织病理改变以及ARBs对T细胞分型的影响。构建大鼠胶原性关节炎(CIA)模型,明确缬沙坦可缓解CIA动物模型病程进程。结果与对照组相比,RA患者血浆中AngⅡ的水平显著升高;口服ARBs的患者血浆中的AngⅡ的水平和抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)显著低于RA患者。并且血浆中AngⅡ的水平与CCP和单核细胞数量呈正相关,与红细胞数和血红蛋白含量成负相关。HE和Masson染色发现,与对照组患者相比,RA患者滑膜组织显著增生,血管翳形成并伴随大量炎症细胞浸润。免疫组化结果显示,RA患者滑膜组织CD4+T细胞浸润明显。通过Western blot和免疫荧光检测结果显示,血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)在CD4+T细胞和RA患者滑膜组织中表达水平显著上调。缬沙坦对CIA大鼠具有治疗作用。结论血浆中AngⅡ水平可能与机体CCP水平以及RA疾病严重程度成正相关。RA患者口服ARBs类药物能下调CCP水平延缓疾病进程。为ARBs类药物成为RA伴高血压患者首选的降压药提供理论和实验依据。

临床药理学教学中多媒体教学的使用与反思

随着计算机技术和网络技术的高速发展,多媒体技术已经在各个行业中得到了广泛地应用。多媒体技术直观生动的表述方式,简洁快速的操作环境,强大的文字图像视频处理功能使其很快成为了教师教学的有力帮手。利用多媒体课件来解释临床药理学一些晦涩的专有名词或复杂的机制过程,有助于激发学生的学习热情从而提高教学效果。但是多媒体教学有别于传统教学的特点也同时为临床药理学的教学带来了一些新的问题。笔者在本文中分析多媒体在临床药理学教学中的优势和缺点,并提出了一些可能的改进策略。

成像流式细胞术在检测巨噬细胞吞噬肿瘤细胞中的应用

分别用Cytomics FC500型流式细胞仪和ImageStreamX MarkⅡ成像流式细胞仪检测小鼠来源RAW264.7细胞转染对照组NC mimics和微小RNA-22(miR-22)mimics之后吞噬鼠源胶质瘤细胞系GL261的百分比,并观察两种检测技术检测结果的相关性和一致性。结果显示,两种流式细胞术测得的RAW264.7细胞(NC mimics组和miR-22 mimics组)吞噬GL261细胞的比例的相关性良好(R 2>0.8),两者结果差异有统计学意义(P<0.05)。Bland-Altman法分析两种检测技术测得RAW264.7细胞(NC mimics组和miR-22 mimics组)吞噬GL261细胞的比例偏倚较小,分别为4.289%和8.073%。与对照组NC mimics比较,miR-22 mimics组RAW264.7细胞吞噬肿瘤细胞能力增加(P<0.05),成像流式细胞术还可获得吞噬过程的单个细胞图片。经典流式细胞术操作方便,速度较快,而成像流式细胞术建立在传统流式细胞术基础之上,实现了对细胞图像进行多参数量化分析,能获得全新的细胞形态统计。

胶原抗体联合LPS建立C57BL/6小鼠关节炎模型

胶原抗体诱导性关节炎(CAIA)是一种新颖的关节炎小鼠模型,与胶原诱导性关节炎(CIA)模型相比,CAIA不需要7周以上才出现关节炎表型,对于CIA模型不敏感的品系也有较好的诱导效果。然而,使用的高剂量诱导剂,一方面给小鼠带来严重的不良反应,甚至出现死亡现象,另一方面也导致5-克隆胶原抗体混合物的不必要浪费。降低5-克隆胶原抗体混合物和脂多糖(LPS)的使用剂量,在避免模型小鼠死亡,节约5-克隆胶原抗体混合物的同时,成功高效诱发C57BL/6小鼠关节炎模型,为类风湿关节炎(RA)发病机制的研究提供了有效方法。

利用活细胞工作站构建巨噬细胞吞噬子宫内膜癌细胞的体外模型

目的利用活细胞工作站观察巨噬细胞吞噬子宫内膜癌细胞的过程及流式细胞术检测巨噬细胞吞噬肿瘤细胞对T细胞的活化。方法将Ishikawa细胞与THP-1诱导的巨噬细胞分别用CFSE荧光探针和CD11b标记,混合接种于成像皿,实时记录120 min内巨噬细胞对Ishikawa细胞的吞噬,流式细胞术检测巨噬细胞与Ishikawa细胞共培养后对T细胞活化的影响。结果共培养的2种细胞相互接触后Ishikawa细胞的绿色荧光被巨噬细胞摄取,且巨噬细胞能连续吞噬多个Ishikawa细胞。吞噬了Ishikawa细胞的巨噬细胞能诱导细胞毒性T细胞分化。结论成功利用活细胞工作站构建巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的体外模型,为检测巨噬细胞及T细胞对肿瘤细胞双重杀伤作用提供可行的实验方法。

高阶能力导向的临床药理学创新教学课程设计

临床药理学是研究药物与人体之间相互作用过程和规律的交叉学科,是医学生培养体系中基础与临床相结合的重要桥梁课程。安徽医科大学临床药理研究所将临床药理学课程建设与培养医学生高阶能力贯穿本科学生教育全过程。课程主要面向即将进入实习岗位的大学三年级医学专业本科生。该课程的创新教学课程设计旨在提升医学本科生对精准医疗和祖国医药研发的自信心和责任感,培养他们成为有社会责任感和实践意识的创新人才,塑造新时代具备高阶能力的新型临床医生。