应用CRISPR/Cas 9系统构建肺癌细胞系获得AMPKα1基因敲除的稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas 9系统在人肺癌细胞系A549和H460中获得敲除腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(adenosine monphosphate-activated protein kinase,AMPKα1)的稳定表达细胞系。方法根据CRISPR/Cas 9靶点设计原则,设计三条引导RNA(sgRNA),分别构建AMPKα1-CRISPR/Cas9 KO及其HDR质粒。将质粒转染至A549和H460细胞后,筛选稳定的单克隆细胞株。用Western blot鉴定筛选获得的肺癌细胞株是否表达AMPKα1。实验被分为原始对照组和敲除组,采用MTT法检测AMPKα1的肺癌细胞增殖情况。结果经过CRISPR/Cas 9系统处理后,筛选获得的A549和H460敲除AMPKα1稳定细胞株与原始细胞株A549和H460相比,Western blot检测不到AMPKα1蛋白质的表达,差异具有统计学意义(t=137.7,79.17,均P<0.0001)。MTT结果显示,筛选获得的A549和H460敲除AMPKα1的稳定细胞株与原始细胞株A549和H460相比,敲除细胞株的增殖速度明显减弱,差异具有统计学意义(t=3.956~28.16,均P<0.05)。结论CRISPR/Cas 9系统成功建立敲除AMPKα1表达的稳定肺癌细胞株,为进一步研究AMPKα1在肺癌发生发展中的作用提供细胞模型。

CRISPR/Cas9系统构建 ROCK2 基因敲除肺癌细胞系

目的利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法利用Rock-2 CRISPR质粒和Rock-2 HDR质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。

应用CRISPR/Cas9技术建立敲除AIFM1基因的稳定肺癌细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术在肺癌细胞系A549和NCI-H3255中敲除凋亡诱导因子1(AIFM1)基因,并通过筛选,获得稳定的细胞株。方法利用在线数据库GEPIA、CPTAC、Prognosis和SangerBox分析AIF在肺癌的表达和功能。以AIFM1基因为靶点,设计向导RNA(sgRNA)并利用CRISPR RGEN Tools分析其脱靶效率,CRISPR/Cas9技术敲除肺癌细胞的AIFM1基因和倍比稀释法筛选稳定的单克隆细胞株。采用Western blot检测细胞AIF表达水平。结果TCGA和GTEx数据集结果显示,AIF蛋白在肺癌组织阳性表达率比正常组织高,差异有统计学意义(P<0.05);单因素cox和多因素cox分析发现,pT分期和pN分期是独立危险因素(P<0.05);CPTAC数据库显示,与正常阶段相比,AIF蛋白在肺癌的不同分级分期阶段的表达增加(P<0.05)。AIFM1基因在TCA循环、亨廷顿氏症疾病、氨基酸-核苷酸-糖的代谢和氧化性磷酸化通路中富集显著,差异有统计学意义(|NES|>1,P<0.05);3条sgRNA的序列脱靶效率均为0;与野生型肺癌细胞株相比,用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰的肺癌细胞未检测到表达AIF蛋白,且筛选的杀死A549和NCI-H3255的嘌呤霉素浓度分别为0.60~0.80μg/mL和0.60μg/mL。结论AIF在肺癌中表达上调。利用CRISPR/Cas9技术成功建立AIFM1基因敲除的肺癌细胞株,这将为研究AIF在肺癌发生发展机制提供合适的研究材料。

酰基辅酶A短链合成酶在肿瘤中的研究进展

肿瘤细胞的代谢异常活跃,可通过调节代谢酶的水平和功能或获取其他能源物质来满足其能量代谢需要。当肿瘤细胞缺氧或葡萄糖受限时,可利用短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)作为其能量物质来源。酰基辅酶A短链合成酶(acyl-CoA short chain synthetases,ACSSs)能够催化SCFAs合成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A是一种关键的代谢中间产物,不仅为肿瘤细胞的存活提供能量供应,且是蛋白质乙酰化修饰的供体。蛋白质乙酰化是一种重要的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs),参与调节细胞行为,在肿瘤的发生发展中起一定的作用。研究ACSSs在肿瘤细胞中的代谢,尤其是应激代谢状态中的作用具有重要意义。为此,本文对近年有关ACSSs的研究进行综述,以期为ACSSs在肿瘤中的研究提供帮助。

免疫调节细胞影响特发性肺纤维化的研究进展

免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞等是机体抵御外来病原体入侵的先行军,在早期急性炎症和后期损伤修复中均发挥了重要的调节作用。近年研究发现免疫细胞的聚集、生长增殖和活化会加重慢性肺泡微损伤,导致损伤修复功能持续失调。这一系列免疫调节对特发性肺纤维化有驱动作用。因此,本文旨在回顾各种免疫细胞在特发性肺纤维化发病机制中的作用以及针对免疫细胞调节治疗特发性肺纤维化的最新研究报道。