猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究

本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CSFv E2蛋白的McAb。用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELISA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高。方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200。特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高。最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符。上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法。

奶牛孕酮酶联免疫检测试剂盒的研制

为了掌握母牛孕酮水平变化信息,为发情鉴定、妊娠鉴别和卵巢疾病诊断提供参考依据,根据ELISA基本原理,研制了奶牛孕酮ELISA检测试剂盒。结果表明,采用孕酮-牛血清白蛋白(P4-BSA)交联物解决了在酶标板上包被抗原的问题,且抗原容易保存;而利用孕酮-卵清白蛋白(P4-OVA)交联物免疫兔子获得高效价抗体,能阻断1 ng/mL孕酮水平;并以ELISA棋盘测定法确定P4-BSA 2000倍、血清500倍稀释为该试剂盒最佳工作浓度。该试剂盒以牛粪作为检测样品,即通过粪便中的孕酮水平变化可为奶牛发情鉴定、妊娠鉴别、繁殖障碍性疾病诊断提供可靠的技术支撑。

RNA病毒质控物研究进展

RNA质控物是病毒分子生物学检测的关键因素,病毒颗粒和裸露的RNA片段由于有生物传染性,易降解而适合用作RNA质控物。近年来发展起来的内含靶RNA序列的盔甲RNA生物安全性高、不易降解、能全程参与病毒核酸的提取和反应,是理想的RNA病毒质控物。

实验猴沙门菌可视环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为了促进环介导等温扩增(LAMP)技术的推广应用,在传统LAMP反应体系中引入羟基萘酚蓝指示剂,建立可视LAMP方法,对反应体系进行高温-低温前处理和添加甜菜碱等优化措施提高检测敏感性,液面覆盖矿物油降低气溶胶污染,据此建立的猴沙门菌可视LAMP检测方法敏感度为6CFU/反应(25μL体系),结果判定直观明了,与其他细菌无非特异性反应,检验效率和检出率均优于细菌培养鉴定法。

实验猴结核病检出率的探讨

本文综合实验猴结核病变态反应和ELISA试验两种检疫方法的特点,并根据结核病细胞免疫与体液免疫相分离的理论基础,对两种结核病检疫方法互相配合使用,以提高猴结核病不同感染时期的检测敏感度。

猴小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种能快速检测猴小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR方法.方法 以小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素基因的保守区为靶区域设计特异引物和探针,建立一种能快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、线性相关性、重复性等因素进行试验.结果 建立的荧光PCR法对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有特异的反应性,最低检出限为3.3×10 cfu/ml,菌液浓度在3.3×10〈＇7〉cfu/ml至3.3×10cfu/ml时与Ct值有较好的线性关系,试验重复性良好.结论 建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光PCR检测方法适用于猴小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测.

RNA标准物病毒样颗粒表达系统的构建及其特性研究

为了构建RNA病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)表达系统pET28a(+)-MS,将插入的外源基因诱导表达获得相应的RNA标准物质病毒样颗粒,将MS2噬菌体包膜蛋白和成熟蛋白基因插入表达质粒pET-28a(+),构建pET28a(+)-MS重组子,将带有包装位点序列的外源RNA对应的cDNA插入成熟蛋白基因的下游,经过诱导表达含外源RNA病毒样颗粒。结果表明,pET28a(+)-MS能表达活性的包膜蛋白(49.8ku)和成熟蛋白(14.4ku),能将外源基因RNA包装成病毒样颗粒,该VLP长度约1 500bp,RT-PCR反应性优良,能耐受RNase的降解,在血清中37℃经1个月未有明显降解。

奶牛孕酮—卵清蛋白交联物、孕酮—牛血清白蛋白交联物的制备

采用碳二亚胺法合成孕酮—卵清蛋白交联物(P4-OVA)、孕酮—牛血清白蛋白交联物(P4-BSA);用孕酮—卵清蛋白(P4-OVA)交联物作为抗原免疫兔子,获得高效价抗体;用孕酮—牛血清白蛋白交联物(P4-BSA)作为包被抗原,通过牛血清白蛋白将抗原牢固地连接在酶标板上,包被后的抗原在4℃保存一年使用效果良好。为奶牛孕酮检测ELISA试剂盒的研制奠定了基础。

可视环介导恒温扩增技术检测实验猴小肠结肠炎耶尔森菌

本研究在传统环介导恒温扩增反应体系中引入羟基萘酚蓝指示剂,对反应体系进行高温-低温前处理和添加甜菜碱等优化措施提高试验敏感性,液面覆盖矿物油降低气溶胶污染,据此建立的猴小肠结肠炎耶尔森菌可视LAMP检测方法结果判定直观明了,敏感度为6 CFU/反应,无非异性。

肉制品中6种人工合成色素的快速测定

目的:建立一种同时测定肉制品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和酸性红6种人工合成色素的高效液相色谱法。方法:采用乙醇-氨溶液提取样品中的色素,经乙醚脱脂,用Agilent Poroshell 120 SB-C_(18)色谱柱分离,以乙腈-乙酸铵(0.02 mol/L)为流动相,二极管阵列检测器可变波长程序测定。结果:6种色素在浓度0~10μg/mL均有良好的线性关系,线性系数均大于0.9999,加标回收率为70.33%~93.08%,检出限为0.12~0.21 mg/kg,相对标准偏差均小于5%。结论:该方法操作简单、快捷,重现性好,灵敏度高,可同时测定肉制品中6种人工合成色素,适用于肉制品的快速检测。

进口越南屠宰用活猪重大动物疫病传入风险评估

为分析进口越南屠宰用活猪传入重大动物疫病的风险,探讨进口越南屠宰用活猪的可行性,参照世界动物卫生组织以及澳大利亚、新西兰等的进口风险分析技术,采用定性评估方法,开展非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等4种进境一类重大动物疫病传入释放评估、接触发生评估和后果评估。评估认为,非洲猪瘟、口蹄疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等疫病具有“高”传入风险,可随活猪引进病原体,并且能够对我国养猪业产生不利影响,因此目前不能接受其进口。针对“高”传入风险,需要制定严格的降低疫病传入风险管理措施,包括严格产地要求、加强境外预检、指定口岸入境、强化隔离检疫、建立生物隔离区。本研究对我国动物产品进口贸易政策及检疫措施的制定提供了有力参考。

双重荧光环介导扩增检测猴空肠弯曲杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌

本试验在环介导恒温扩增体系引入分子信标建立双重荧光环介导扩增方法,利用该方法检测实验猴空肠弯曲杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌,结果敏感性分别达到10-2CFU/m L和10-3CFU/m L,与常见肠道菌无交叉反应。

新型莱克多巴胺试剂盒的测试

为了寻找适合生产上使用的检测莱克多巴胺残留的试剂盒,本试验对一新型莱克多巴胺试剂盒的标准曲线,变异系数,添加回收率做了测试,并对多批次尿样实测。结果该试剂盒最低检测限为0.1ppb,变异系数在15%左右,添加回收率75%~116%,尿样实测结果与实际情况相符。本试验结果表明,这种试剂盒敏感度符合莱克多巴胺低水平残留检测要求。

采用间接血凝试验净化猪瘟的探讨

近几年来，笔者曾处理过近30起约34万头的猪瘟病例，发现采取猪瘟兔化脾淋毒湿苗或兔体组织苘作紧急免疫后，虽得到一定的控制，但这些猪场以后仍有零星的猪瘟出现，使小猪成活率在85％左右。笔者选择2个发生猪瘟的猪场用间接血凝试验测定所有的母猪的抗体水平，淘汰重新免疫后抗体水平仍达不到保护线的母猪，及抗体水平在1：256以上，其后代仍出现猪瘟的母猪，试图用此方法达到净化或逐步减少发病率、提高仔猪成活率的目的。现将试验方法及结果报道如下：