鸭坦布苏病毒非结构蛋白亚细胞定位及其在IFN-β信号通路中的作用

【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白的亚细胞定位及其在β-干扰素(IFN-β)信号通路中的作用。【方法】通过RT-PCR法扩增DTMUV的7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS-HA,构建重组真核表达质粒,并分别转染至HEK-293T细胞,通过Western blotting检测蛋白表达;利用间接免疫荧光试验检测非结构蛋白的亚细胞定位情况,通过双荧光素酶报告试验研究DTMUV的非结构蛋白对鸭源IFN-β启动子活性的影响。【结果】试验成功构建DTMUV的7个非结构蛋白带HA标签的真核表达质粒。Western blotting结果显示,真核表达非结构蛋白均正常表达,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白分子质量大小分别为38、25、14.4、68、13.9、28和100 ku。间接免疫荧光试验结果显示,7个非结构蛋白在细胞内的表达形态不一,主要定位在细胞浆中。双荧光素酶报告试验结果表明,与对照组相比,过表达NS2B和NS4B蛋白后,鸭源IFN-β启动子活性极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了DTMUV的7个非结构蛋白的真核表达质粒,非结构蛋白主要表达于细胞浆中,其中NS2B和NS4B蛋白具有颉颃IFN-β活性的功能。试验结果为DTMUV的免疫逃逸研究提供了一定的理论依据,并为深入探究DTMUV在宿主天然免疫信号通路中的作用机制提供了试验材料。

茶黄素体外抑菌作用研究

通过体外试验研究茶黄素对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠球菌、禽肺炎克雷伯、鸭源鸡杆菌、禽肠炎沙门氏菌、野鸟黏质沙雷氏菌、禽巴氏杆菌的抑菌作用。采用最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定法研究茶黄素的抑菌作用及杀菌作用。结果显示,茶黄素对禽巴氏杆菌、鸭源鸡杆菌等具有抑菌作用,并与其浓度呈正相关,而对大肠埃希氏菌、禽肠炎沙门氏菌、黏质沙雷氏菌等无作用;茶黄素浓度为128μg/mL时,其对鸭源鸡杆菌生长具有抑制作用,当茶黄素浓度为512μg/mL时,其对禽巴氏杆菌C48-1生长具有抑制作用;当茶黄素浓度为512μg/mL时,其对禽巴氏杆菌和鸭源鸡杆菌具有杀菌作用。茶黄素在MBC浓度时能抑制生物被膜的形成能力。结果表明,茶黄素是一种天然抗菌剂,具有优良的替抗前景,促进绿色健康养殖。

血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

旨在从送检的病鸡中分离鉴定出禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV),为临床诊断和疫病防控提供参考依据。本研究将阳性样品接种SPF鸡胚并传代,利用PCR检测、基因序列分析、动物回归试验等方法鉴定病毒。结果:经过鸡胚传代及病毒特异性检测获得了纯净的FAdV,命名为HB2306;分析Hexon基因序列可知,HB2306株属于血清4型分支,与国内外分离的FAdV-4毒株核苷酸序列同源性为98.2%~99.9%,HB2306株与国内外的4型高致病性毒株氨基酸序列相似性在97.9%~99.8%;受试动物临床病理变化显示,HB2306株以104.5EID50/只的剂量经胸部肌肉注射后,引起宿主心包积液,肝脏变黄肿胀、淤血出血,肾出血、肿胀等典型的病理变化,与流行的高致病性毒株所致临床症状相似,且死亡率为100%。综上,本研究成功分离并鉴定出一株FAdV-4高致病力毒株,丰富了毒种库,为该病毒感染的流行情况调查和综合防控奠定了基础。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

生物矿化对新城疫病毒LaSota株生物学特性及免疫原性的影响

旨在研究生物矿化对新城疫病毒(NDV)LaSota株生物学特性及免疫原性的影响,为耐热活疫苗研发提供新思路。通过测定不同矿化条件下病毒粒径、血凝效价和斑点印记,确定NDV的最佳生物矿化条件;将矿化后病毒接种BHK-21细胞,检测矿化对病毒增殖的影响,同时比较热处理后的矿化病毒在BHK-21细胞中的滴度变化情况;利用抗体中和试验检测矿化病毒的免疫原性;最后通过饮水免疫的方式评估矿化病毒在SPF雏鸡上的免疫效果。结果显示:生物矿化条件经优化后,LaSota株在4 mmol·L^(-1)Na_(2)HPO_(4)和3 mmol·L^(-1)CaCl_(2)条件下矿化效果最好,此时矿化病毒粒径最大,血凝效价最低,矿化率高达98.25%。矿化的LaSota株在BHK-21细胞上增殖起始时间迟于未矿化病毒,但两者的最终增殖滴度没有显著差异。经NDV抗体中和后,矿化病毒滴度的下降值为103.0 TCID_(50)·mL^(-1),显著低于未矿化组。在56℃水浴中孵育15 min后,矿化的LaSota株病毒滴度仅下降103.5 TCID_(50)·mL^(-1),与TS09-C耐热株的耐热特性相当。矿化的LaSota株免疫SPF雏鸡14 d后,抗体水平均高于未矿化LaSota株免疫鸡群。免疫后42和78 d进行攻毒试验,矿化LaSota株免疫鸡群的存活率分别为100%和60%。综上所述,本研究优化了NDV LaSota株的最佳矿化条件,矿化会延缓病毒的增殖速度,但不影响病毒的增殖滴度。经矿化后,能降低病毒与抗体的中和反应并提升其热稳定性,并可通过饮水免疫的方式对SPF雏鸡提供较好的保护效果。本研究证实通过生物矿化开发新城疫耐热活疫苗是一条切实可行的思路,也为开发其他病毒耐热活疫苗提供参考和借鉴。

鸡胚免疫新城疫疫苗后宿主法氏囊转录组学分析

【目的】通过转录组学分析鸡胚免疫新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C株后宿主法氏囊内免疫关键基因及信号通路分子转录差异,探究免疫后宿主法氏囊内免疫相关分子的调控反应。【方法】将60只18胚龄SPF鸡胚随机分为免疫组和对照组,30枚/组,免疫组将NDV TS09-C株通过羊膜腔接种鸡胚,剂量为103.0 EID 50/枚,注射体积为0.1 mL,对照组以同样的方法接种等体积PBS。检测免疫后不同时间点肺脏、胸腺、脾脏和法氏囊组织的病毒载量。选取病毒载量最高的法氏囊组织进行转录组学测序后,筛选免疫相关差异表达基因并分析其参与的主要功能及通路。【结果】免疫后1 d法氏囊组织中即可监测到病毒,免疫后3 d病毒载量达到最高。将免疫后3 d的法氏囊进行转录组学分析,与对照组相比,免疫组有453个基因上调、98个基因下调,其中免疫相关基因有36个上调、10个下调。免疫相关差异表达基因主要富集于自噬和细胞因子-细胞因子受体相互作用的免疫相关通路。差异表达基因蛋白互作分析显示,自噬通路中富集的BCL2与其他免疫相关基因有较多互作关系,且在B细胞活化、分化、免疫系统发育等功能注释中均有参与。【结论】本研究结果揭示了鸡胚免疫NDV TS09-C株后法氏囊内调控B细胞活化、分化的潜在靶向基因及通路,为进一步研究该毒株鸡胚免疫后B淋巴细胞调控的分子机制提供新的信息。

竹叶黄酮对鸡胚接种新城疫疫苗免疫效果的影响

【目的】探究竹叶黄酮(bamboo leaf flavonoid,BLF)作为疫苗佐剂对新城疫(ND)疫苗鸡胚接种的免疫效果影响。【方法】试验选取18胚龄SPF种蛋108枚,随机分为3组:Control组(不注射任何物质)、TS组(注射0.1 mL 103.0 EID 50/0.1 mL的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C疫苗株)和BLF+TS组(注射0.1 mL含2%BLF和103.0 EID 50/0.1 mL的NDV TS09-C疫苗株的混合液),每组36枚种蛋。试验期间,统计种蛋的孵化率和雏鸡的存活率,在雏鸡7、14、21、28日龄时,每组随机选取3只进行屠宰,采集脾脏、法氏囊、胸腺组织,统计免疫器官指数;采集雏鸡翅下静脉血液,测定血清抗体和细胞因子水平;在雏鸡28日龄时使用NDV强毒株F48E9进行攻毒保护试验,攻毒后每天观察试验雏鸡状态,记录体重变化情况,并于攻毒后第3天每组随机选取3只雏鸡进行屠宰,取十二指肠、肺脏和气管组织并检测雏鸡不同组织病毒载量。【结果】鸡胚接种后,BLF+TS组雏鸡孵化率为100%,存活率为97.22%。与TS组相比,21~28日龄时BLF+TS组雏鸡的脾脏、法氏囊和胸腺指数以及血清中白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)含量均显著升高(P<0.05)。攻毒试验结果显示,攻毒后BLF+TS组雏鸡存活率为100%,攻毒后2~4 d BLF+TS组雏鸡体重增长速度显著低于健康对照组(P<0.05);攻毒后3~7 d时BLF+TS雏鸡体重增长速度显著高于TS组(P<0.05)。BLF+TS组雏鸡攻毒后呼吸道和消化道组织的病毒载量显著低于TS组(P<0.05)。【结论】BLF作为免疫佐剂可安全进行鸡胚接种,而且能够帮助雏鸡建立早期免疫保护,进一步提高ND疫苗免疫效果,研究结果为开发高效鸡胚免疫疫苗佐剂提供借鉴和参考。

坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立与应用

为了大量表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并建立一种可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法,试验首先将去除跨膜域的截短坦布苏病毒E基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;然后以重组蛋白为包被抗原、鸭待测血清为一抗、HRP标记兔抗鸭IgG为二抗,通过反应条件[抗原包被质量浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、一抗(待测血清样品)稀释液、一抗(待测血清样品)稀释度、一抗(待测血清样品)孵育条件、二抗稀释度、二抗孵育条件和显色条件]的优化和临界值的确定建立间接ELISA方法;最后进行特异性、敏感性和重复性试验,并通过临床样品检测比较该方法与Western-blot方法的符合性。结果表明:PCR扩增得到大小为1227 bp的坦布苏病毒截短E基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-E-tr。诱导后的重组蛋白分子量大小为49 ku并以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白条带单一,可与鸭源坦布苏病毒阳性血清发生特异性结合。建立的ELISA方法优化后的抗原包被质量浓度为5μg/mL,抗原包被条件为4℃过夜,封闭液为2%BSA,封闭时间为60 min,一抗(待测血清样品)稀释液为1%BSA,一抗(待测血清样品)稀释度为1∶800,一抗(待测血清样品)孵育条件为37℃、30 min,二抗稀释度为1∶7500,二抗孵育条件为37℃、90 min,显色条件为37℃、10 min,阴阳临界值为0.368;仅可检测出鸭源坦布苏病毒阳性血清,无法检测出鸭源鸭疫里默氏杆菌、新城疫病毒、禽腺病毒、禽流感病毒、细小病毒阳性血清;待测血清最高稀释度为1∶3200(Western-blot方法待测血清最高稀释度仅为1∶1600);批次内重复变异系数(CV)为1.7%~4.7%,批次间重复CV为1.4%~5.7%;对137份临床鸭血清样品进行检测,阳性率为81.7%,与Western-blot方法比较样品阳性率较高,两种方法的符合率为87.6%。说明成功表达了坦布苏病毒截短E蛋白,并建立了一种特异性良好、敏感性较高、重复性较好的可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。

应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒

采用荧光定量PCR技术对猪瘟病毒进行快速定量检测.实验证明,该方法的检测灵敏度可达10拷贝/μL,对于不同毒株以及各种组织样品检测结果均为阳性.通过该方法与RT PCR、nPCR的比较,发现该方法检测灵敏度比RT PCR高100倍,与nPCR具有相同的灵敏度,并且该方法避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率.因此,该方法以其快速、灵敏、低污染率的优点,会在猪瘟的早期检测及预防、控制上起到重要作用.

新城疫病毒TS09耐热株在BHK细胞上的传代培养

以新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)TS09耐热株为研究对象,研究了该毒株在幼仓鼠肾传代细胞(BHK细胞)上的培养适应性。通过培养条件的优化、连续传代培养和极限稀释法纯化,获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株,命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明,TS09-C株在BHK细胞中的增殖滴度为107.9TCID50/mL,平均鸡胚致死时间(MDT)大于120 h,脑内致病指数(ICPI)为0。与亲本株TS09株相比,TS09-C株的基因序列发生了较为明显的改变,但TS09-C株与亲本株仍保持着较近的遗传进化关系。

猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(ΔE2)。PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-ΔE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组ΔE2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达。KCl预染切胶法纯化ΔE2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法。用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%。为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。

新城疫病毒耐热弱毒TS09-C株反向遗传操作系统的建立

为了建立新城疫病毒(NDV)耐热弱毒株的反向遗传操作平台,以NDV TS09-C耐热弱毒株为研究对象,构建了TS09-C株的全长c DNA克隆质粒和3个分别表达NP、P和L的辅助质粒。通过4个质粒共转染预感染有表达T7 RNA聚合酶的痘病毒的BHK-21细胞,拯救出了重组病毒r TS09-C株。生物学特性试验结果表明,重组病毒r TS09-C株具有与亲本株相似的耐热、弱毒和细胞增殖特性。NDV耐热毒株反向遗传操作系统的建立为耐热活疫苗载体的研究,进一步研发新型多联(多价)耐热禽用活疫苗提供了技术平台,也为耐热机理的研究打下基础。

猪圆环病毒2型HBZX株的全基因组克隆及序列分析

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序列测定与分析。结果显示,PCV2 HBZX株的基因组全长为1 767nt;同源性比较发现,HBZX株与其他PCV2株的核苷酸同源性为95.0%～98.9%;遗传进化树分析表明,根据PCV2全基因组序列和ORF2编码蛋白的氨基酸序列所绘制的遗传进化树相似度较高;PCV2可分为两个亚型,以中国株为代表的亚洲株和以加拿大株为代表的美洲株分布在亚型1中,以法国株为代表的欧洲株分布在亚型2中。说明PCV2各分离株之间存在较为明显的地理位置上的相关性。

基于Taqman-MGB探针的猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法的研究

应用MGB荧光RT-PCR技术对猪瘟病毒野毒株进行实时定量检测,以实现对猪瘟病毒野毒株与疫苗株的鉴别诊断。以猪瘟病毒5'端非编码区为扩增靶区,通过鉴别诊断位点的筛选、引物、探针和反应条件的优化,建立了猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应或3.0 TCID50/反应;对猪瘟病毒野毒株的检测结果均为阳性,而对猪瘟病毒疫苗株和其他猪源病毒的检测结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性;对515份临床样品的检测结果表明,该方法与RT-nPCR测序法的检测符合率为98.3%;猪瘟病毒人工感染猪实验结果表明,猪瘟野毒感染猪发病前2-4天即可被检测出阳性,疫苗免疫株检测结果始终为阴性。

猪瘟病毒感染性cDNA克隆的构建及其致病性

为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM。通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK 15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子。再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线,通过电镜观察到重组病毒呈球形,具有囊膜结构。进一步把获得的猪瘟病毒粒子感染非免疫实验猪,结果子代病毒与石门株类似,对非免疫实验猪有强烈的致病性,证明该全长cD NA克隆可靠稳定,忠实地保留了石门株病毒的感染性和致病特征。由此为进一步探讨猪瘟病毒的致弱机制及病毒与机体相互作用的机制打下了良好的基础。

湖北省部分地区鸭致病性大肠杆菌的分离与血清型鉴定

鸭大肠杆菌病是一种急性败血性传染病，因而又名鸭大肠杆菌败血病。该病在临床剖检上主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。各种年龄的鸭均可感染，雏鸭最易感，2～6周龄多发，发病率和死亡率较高，在商品肉鸭中死亡率可高达50％左右，而且常常与鸭传染性浆膜炎混合感染，成年鸭和种鸭主要表现为零星死亡。随着养鸭业的日益发展和集约化程度的提高，鸭大肠杆菌病的发生日趋严重，给养鸭业造成了严重的经济损失。

鸡心包积水综合征病原的分离与鉴定

2015年8月,河南和湖北某鸡场发生了以心包积水为典型特征的疫情,具有较高的发病死亡率。临床剖检分析为疑似心包积水综合征,病原可能为禽腺病毒。采集心包积水液的病鸡肝脏、心脏等病料接种SPF鸡胚进行病毒分离,同时对病料和接种后的鸡胚尿囊液进行禽腺病毒的PCR检测及序列分析。结果：在病料与尿囊液中均检测出大小约649 bp的片段,将分离到的两株病毒分别命名为HBHP1510和HNXZ1510;序列分析结果表明,两株病毒的同源性为99.6%,与腺病毒4型的同源性最高,为95.1%-97.5%;遗传进化分析表明两株病毒与禽腺病毒4型的亲缘关系最近。本研究表明,此次从心包积水综合征病死鸡中分离的病毒为禽腺病毒Ⅰ亚群4型。

禽霍乱·新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究(Ⅲ报)——疫苗对鸭和鹅的安全性及免疫效力试验

[目的]为禽霍乱、新城疫二联油乳剂灭活疫苗免疫鸭和鹅等水禽提供理论依据。[方法]将禽A型多杀性巴氏杆菌接种固体培养基收获的菌液与鸡新城疫病毒弱毒株La Sota接种易感鸡胚收获的感染鸡胚液混合,用甲醛溶液灭活后制备成5批二联油乳剂灭活苗,用于鸭和鹅的安全性及免疫效力试验。[结果]5批二联苗对鸭和鹅的安全性试验表明,免疫鸭和鹅均未出现任何不良反应;免疫效力试验表明,免疫后3周,鸭和鹅的新城疫血凝抑制抗体效价均≥4 log2,新城疫攻毒保护率均为100%,禽霍乱攻毒保护率为66.7%-83.3%。[结论]该二联苗用于免疫鸭和鹅安全可靠,免疫效果良好。

湖北省部分肉鸡场致病性大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

对湖北省部分肉鸡场的大肠埃希菌病流行病学进行调查,从采集的50份发病及死亡鸡肝脏、心脏和气囊中共分离出21株大肠埃希菌,对其培养特性、形态特征、生化特性、致病性进行了研究,初步鉴定为大肠埃希菌。同时对分离的21株大肠埃希菌的O群抗原进行了血清型鉴定,其结果为10株O78、6株O18,2株O1,还有3株有待于进一步的血清型鉴定。动物试验表明,已鉴定出血清型的18株大肠埃希菌均有不同程度的致病性。选择临床上常用的15种药物进行药敏试验,结果显示鸡大肠埃希菌的耐药性已经到了非常严重的程度。

鸡产气荚膜梭菌的分离鉴定及药敏试验

为调查湖北地区健康鸡群中产气荚膜梭菌的分布状况,从规模化养鸡场采集鸡肛门棉拭子样品,应用厌气肉肝汤和CW琼脂培养基培养、紫牛乳反应、革兰染色及生化试验进行细菌的分离鉴定,应用多重PCR方法对分离菌株进行基因分型,并对分离菌株进行体外药敏试验。结果从120份样品中分离到9株(7.5%)产气荚膜梭菌,多重PCR都只扩增出α条带,毒素基因分型结果均为A型。药敏试验结果显示,分离菌株对链霉素、新霉素、丙氟哌酸、环丙沙星耐药,对丁胺卡那霉素,氯洁霉素中度敏感,对氨苄西林、阿莫西林、四环素、头孢噻肟高度敏感。