过表达TLR2分子的B淋巴细胞系模型的建立

为构建稳定表达人源TLR2分子的B淋巴细胞系模型,将编码人TLR1、TLR2和TLR6的基因分别克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-puro慢病毒载体上,测序正确后经293T细胞包装成完整具备感染性的病毒颗粒,转染Nalm-6细胞(TLR2^(-)),嘌呤霉素筛选获得稳定表达TLR2分子的Nalm-6细胞(TLR2^(+))。利用倒置荧光显微镜观察细胞状态和绿色荧光表达情况,通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测相关蛋白表达水平,采用CCK-8以及流式细胞术检测细胞存活率和细胞增殖水平。结果显示:倒置荧光显微镜下可见成功转染慢病毒的Nalm-6细胞表达绿色荧光和嘌呤霉素抗性。Western Blot检测到TLR2在Nalm-6细胞中成功表达,且TLR2信号的激活明显增强PI3K-AKT信号轴分子的磷酸化水平。CCK-8和流式细胞术发现TLR2活化可提升细胞存活率,促进细胞增殖。研究成功构建了过表达TLR2分子的B淋巴细胞系模型,并在此基础上验证TLR2活化不仅能够增强B细胞PI3K-AKT信号通路传导,还可促进细胞增殖。此模型为进一步探究TLR2通路对B细胞抗感染免疫功能的影响奠定基础。

生长抑素及奥曲肽的肝细胞保护作用及其机制研究

目的:探讨生长抑素(SST)及其类似物奥曲肽(OCT)对大鼠肝细胞的保护作用及其机制。方法:以原代培养肝细胞建立无水乙醇/四氯化碳(CCl4)细胞损伤模型,观察SST及OCT预处理对培养上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量的影响。此外,将75只SD大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组及大、中、小剂量SST治疗组。除正常对照组外均以40%CCl4皮下注射8周,期间各SST治疗组分别给予SST200μg·kg-1·d-1、100μg·kg-1·d-1、50μg·kg-1·d-1。采用酶试剂法、末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法(TUNEL)分别检测肝功能及肝细胞凋亡指数。结果:经SST(10-8-10-6mol/L)及OCT(10-7-10-5mol/L)预处理后,损伤模型组肝细胞的培养上清液中ALT、AST水平显著下降。不同剂量SST治疗还能明显降低肝纤维化大鼠的血清ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)及总胆红素(TBIL)水平,提高血清清蛋白(ALB)水平,抑制肝细胞凋亡,其中小剂量SST治疗组最佳。结论:SST及OCT可减轻CCl4引起的肝细胞损伤,改善肝功能,并抑制肝细胞凋亡,可能在肝纤维化的防治中发挥重要作用。

生长抑素对肝星状细胞的影响机制

目的:研究生长抑素(somatostatin,SST)与大鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)增生、凋亡的关系.方法:分离、培养的原代大鼠HSC,经不同浓度SST(10-6-10-10mol/L)处理72h后,以吖啶橙(acridineorange,AO)/溴乙啶(ethidiumbromide,EB)荧光染色法、末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)、透射电镜及流式细胞术检测其凋亡率的改变.SST作用120h后,以甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)比色法检测HSC增生率的变化.并通过对细胞动力学的观察,探讨SST的作用机制.结果:SST可通过剂量依赖方式抑制HSC增生,提高HSC凋亡率.浓度为10-6mol/L或10-7mol/L时效果尤为显著.G0/G1期阻滞是SST发挥作用的重要途径.结论:低剂量SST即可抑制HSC增生,并促进其凋亡,提示SST在抗肝纤维化方面具有潜在价值.

藏药“生等”的化学成分研究(Ⅰ)

首次从藏药“生等”，即鼠李科猫乳属植物西藏猫乳Rhamnellagilgitica的干燥心材中分离并鉴定了9个黄酮体化合物，分别是墨沙酮（maesopsin，Ⅰ），香橙素（aromadendrin，Ⅱ），柚皮素（naringenin，Ⅲ），山柰酚（kaempferol，Ⅳ），懈皮素（quercetin，Ⅴ），花旗松素（taxifolin，Ⅵ），顺-4，6，4’-三羟基异噢［（z）-4，6，4’-trihydroxyaurone，Ⅶ］，4，6，4’-三羟基异噢（4，6，4’-trihydroxyisoaurone，Ⅷ），山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖甙（kaempferol-7-O-β-D-glucoside，Ⅸ）．其中化合物Ⅰ为主要成分，得率0．41％；化合物Ⅷ为首次从天然界获得。

甘遂中巨大戟萜醇型二萜酯类化学成分的研究

目的 分离鉴定甘遂 Euphorbia kansui中巨大戟萜醇 (ingenol)型二萜酯类化学成分。方法 运用波谱技术 ,尤其是 2 DNMR技术 (1 H- 1 HCOSY,HSQC,HMBC和 NOESY实验 )进行结构鉴定。结果 分离得到 6个巨大戟萜醇型二萜酯 ,确定了其中两个主要化合物的结构 ,分别为巨大戟萜醇 - 3- 2′E,4′Z癸二烯酯 - 2 0 -乙酸酯 [3- O- (2′E,4′Z- decadienoyl) - 2 0 - O- acetylingenol]( )和甘遂大戟萜酯 C(kansuiphorin C) ( )。结论 首次报道了 的全部 NMR数据和 的碳谱数据 ,并利用多种 2 DNMR技术对 和 的全部 NMR数据进行了归属。

狼毒大戟中4种Jolkinolide型二萜的二维核磁共振研究

目的 :应用NMR技术对狼毒大戟中Jolkinolide型二萜jolkinolideA和B以及 17 hydroxyjolkinolideA和B的1 H和1 3 CNMR信号进行了准确归属。方法 :运用 2DNMR技术 (1 H 1 HCOSY、HSQC、HMBC和NOESY实验 )和选用高灵敏度低噪音的二维脉冲序列、反式梯度场探头。结果与结论 :首次准确地归属了 4种Jolkinolide型二萜NMR谱中1 H、1 3 C信号的化学位移 ,并确定了 17

类人慢性粒细胞性白血病小鼠模型的建立

目的：为了进一步阐明慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的发病机制、寻找新的治疗靶点，有必要建立CML动物模型。方法：首先改进逆转录病毒包装技术，在相同实验条件下，改变以下条件之一，如质粒的质量、包装细胞的状态、转染当天包装细胞的密度等，进行病毒滴度的测定，优化实验条件后进行后续实验。实验组为BCR／ABL（含BCR／ABL融合基因的逆转录病毒载体）组小鼠。供体小鼠经5-氟尿嘧啶（5．FU）预处理后，骨髓细胞经p210BCR／ABL逆转录病毒上清感染，感染的骨髓细胞经尾静脉注射给经致死剂量X光照射的受体小鼠。观察移植后BCR／ABL组小鼠的活动情况、发病鼠外周血和骨髓的细胞形态、肝脾病理改变等。同时观察MigRl（逆转录病毒空载体）组小鼠。结果：通过提高质粒的质量、改善包装细胞的状态、优化转染当天包装细胞的密度等，提高了病毒的滴度，用于小鼠移植模型实验。BCR／ABL组小鼠均于移植后19—25d发病死亡。发病时外周血及骨髓均见中晚幼及成熟粒细胞大量增生，肝脾肿大伴正常结构破坏及大量粒细胞浸润。MigR1组小鼠均无发病。结论：通过改进逆转录病毒包装技术，提高包装病毒的滴度，我们在体外将BCR／ABL转入小鼠骨髓细胞并移植入受体小鼠，成功建立了类人CML小鼠模型。

肝纤维化逆转中MAPK/ERK信号转导通路的活化及其特征

目的探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase,ERK)信号转导通路与肝纤维化自发逆转的相关性。方法采用CCl4注射SD大鼠8周,随后停药6周建立肝纤维化自发逆转的动物模型。采用cDNA微阵列杂交检测纤维化消退期间MAPK/ERK级联反应中有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase,MAPKKK)、MAPKK、MAPK等上下游激酶的表达变化。并通过Northern杂交加以验证。结果肝纤维化自发逆转过程中,H-ras、A-raf、MAPKK2、ERK1及核糖体S6蛋白激酶(S6proteinkinase,RSK1)等MAPK/ERK信号转导通路中的关键激酶表达水平均显著提高,并呈现顺序激活的时序关系,ras抑制物的转录则明显下调。结论MAPK/ERK信号通路在肝纤维化消退时明显活化,可能与纤维化的自发逆转密切相关。

运用SELEX技术筛选特异性高亲和IVB型纤毛结构蛋白RNA适配子

目的 获得特异性高亲和IVB型纤毛结构蛋白prepilS的RNA适配子 (aptamers) ,为开发预防、治疗伤寒杆菌肠热症的新型药物试剂奠定基础。方法 采用SELEX技术 (SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEn richment)筛选IVB型纤毛结构蛋白prepilS的特异性适配子 ,通过体外构建一个长度为 88nt含有 30个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库 ,PCR扩增为双链DNA随机文库后 ,体外转录构建RNA随机文库 ,以Sepharose 4B为筛选介质 ,筛选具有特异性高亲和力prepilS蛋白的RNA适配子。结果 经 8轮筛选获得具有特异性高亲和prepilS蛋白的RNA适配子库。结论 成功地筛选出具有特异性高亲和力的RNA适配子库 ,该RNA适配子库可显著抑制伤寒杆菌侵入THP

藏药“生等”的化学成分研究(第2报)

首次从藏药“生等”，[鼠李科猫乳属植物西藏猫乳（Rhamnellagilgitica）Mansf．etMelch）]的干燥心材中分离矿鉴定了6个化合物，一个混合脂肪酸酯及一个混合脂肪酸，它们分别是大黄酚（Chrysophanol，I），没食子酸（Gallicacid，Ⅱ）、β-谷甾醇（β-Sitosterol，Ⅲ）．胡萝卜甙（Daucosterol，Ⅳ）、二十四烷酸（V）、十六烷酸（Ⅵ）、十六与十八烷酸甲酯混合物（Ⅶ），二十二～二十六烷酸混合物（Ⅷ）。

肝纤维化自发逆转的相关信号转导通路研究

目的探讨肝纤维化自发逆转过程中不同信号转导通路的改变。方法通过四氯化碳(CCl4)注射SD大鼠8周,随后停药6周建立肝纤维化自发逆转的动物模型。采用cDNA微阵列杂交、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等检测多种信号通路成员的表达变化。结果除MAPK/EKR信号通路外,与肝纤维化自发逆转相关的差异表达基因属于数条信号转导通路,包括:SAPK/JNK信号通路中的SAPKβ、JunB原癌基因、JunD原癌基因、p53;MEK5信号通路中的MAPKK5;PI3K/Akt信号通路中的1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶、1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶B、HSP90 β、v-akt;Notch信号通路中的PS2。针对SAPK β、MAPKK5、1,4,5-三磷酸肌醇3-激酶及PS2的RT-PCR检测,结果与cDNA微阵列杂交相吻合。SAPK/JNK及Notch信号通路中的关键基因表达降低,MEK5、PI3K/Akt信号通路中的核心激酶表达水平上升,均可能促进肝细胞增殖、抑制其凋亡,从而诱导肝纤维化逆转。结论SAPK/JNK、MEK5、PI3K/Akt及Notch信号通路可能通过协同效应,在肝纤维化的自发逆转过程中发挥重要作用。

原发性胆汁性肝硬变的发病机制及药物治疗

原发性胆汁性肝硬变是由肝内外胆道系统长期胆汁瘀积引起的慢性进行性脂肪变性疾病.通常发生于更年期或绝经期的女性;发病率约1/50000～1/160000;具有高免疫球蛋白血症,自身抗体阳性等特征.病理上表现为汇管区或小叶间胆管呈分段性、斑块性损害或汇管区胆小管广泛增生,伴急性或慢性炎性细胞浸润及纤维变性.发病机制至今不甚明确,缺乏理想的治疗药物.近年来认为与自身免疫有关,也可能与遗传和雌激素水平改变有一定关系.为此,人们已尝试应用多种药物治疗原发性胆汁性肝硬变.

永生大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定(英文)

目的建立永生性大鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)系。方法采用改良胶原酶原位灌注法消化肝脏,经Nycodenz密度梯度离心分离、鉴定成年Sprague-Dawley大鼠的HSC。然后通过细胞克隆建立HSC系(HSC-PQ)并传代培养。结合细胞动力学、光镜、透射电镜及免疫细胞化学技术检测HSC-PQ系的倍增时间、(平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)及结蛋白表达、细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成等表型特征。结果分离获得的HSC约为2×107细胞/只大鼠,细胞成活率>95%,纯度>90%,培养2周后几乎所有HSC均已活化。在此基础上经细胞克隆所得的HSC-PQ系表型类似成纤维细胞,倍增时间约75h,可表达结蛋白、α-SMA以及除IV型胶原外的多种ECM成分(I型胶原、III型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等),且传代过程中增殖、ECM表达等特性均保持稳定。该细胞系已在体外培养32代(1a以上),提示其具有永生性。结论已成功建立永生性大鼠HSC系,该细胞系的基本特征与活化的原代HSC相似。

大鼠CCl_4所致肝纤维化自发逆转的基因表达谱研究

目的:利用cDNA微阵列杂交筛选肝纤维化自发逆转过程中的差异表达基因,从而揭示纤维化逆转的基因表达谱. 方法:通过四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)注射SD大鼠8 wk,随后停药6 wk建立肝纤维化自发逆转的动物模型.提取纤维化逆转过程中不同时间段的肝组织mRNA,与cDNA微阵列杂交,筛选表达水平明显上调或下调的差异基因,并结合Cluster分析等进行分类.此外选择α共核蛋白、A-raf、早老素2及β肌动蛋白作RT-PCR以验证检测结果. 结果:CCl4诱导的肝纤维化在停止毒剂注射后出现进行性消退.cDNA微阵列杂交证实,肝纤维化消退过程中共有254条基因出现转录水平改变,占基因总数的21.59%. 其中8,10,12,14 wk的差异表达基因分别为54, 85,97,132条.筛选所得的肝纤维化逆转相关基因主要涉及代谢相关酶、脂肪代谢相关蛋白、离子通道、转录因子、胃肠激素及受体、MAPK及PI3k/Akt信号转导通路等.RT-PCR检测与cDNA微阵列杂交一致,证实了结果的可靠性. 结论:肝纤维化逆转过程中基因表达谱发生显著改变, 主要涉及代谢相关酶、转运蛋白/协同转运蛋白、胃肠激素及受体、脂蛋白/脂肪酸结合蛋白、转录因子/ 核因子、MAPK信号转导通路等6类基因.

高脂饮食诱导非酒精性脂肪性肝病动物模型的研究进展

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝细胞脂肪变性为主要特征,但无过量饮酒史的临床病理综合征。研究证实,通过胆固醇和/或脂肪为主的高脂饮食可建立NAFLD的动物模型。然而,在动物选择、高脂饮食配方、喂食条件、造模时间、肝脏病变程度等方面仍需进行深入探索。此文对相关的研究进展作一综述。

肠源性高血氨在非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是与遗传易感和代谢功能障碍密切相关的脂肪性肝病,疾病谱包括单纯性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及其相关肝纤维化和肝硬化[1]。随着全球肥胖和代谢综合征的流行,NAFLD已成为包括我国在内的全球第一大慢性肝病。与欧美人种不同,亚洲人在相同体质指数(body mass index,BMI)的情况下,有更多的体内脂肪含量和相对较少的骨骼肌含量。

O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在脑胶质瘤的表达及其临床意义

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在脑胶质瘤细胞中的表达及其与患者生存时间的关系,以判断患者的预后,并指导胶质瘤术后化学治疗药物的合理选择。方法选取手术切除的59例脑胶质瘤标本,经10%甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋;每例标本以5μm厚度连续切片,作HE染色确定病理组织类型;对患者的生存期进行调查;用免疫组化EnVision法检测脑胶质瘤细胞中MGMT的表达情况;免疫反应染色结果按照Krajewska法进行半定量分析;所有统计分析用SPSS17.0统计软件进行,采用卡方检验以及将MGMT表达与患者生存期绘制成Kaplan-Meier生存曲线,并进行log-rank检验和分析。结果 MGMT在脑胶质瘤的表达存在异质性;MGMT在不同病理级别的脑胶质瘤细胞中表达阳性率不同,差异无统计学意义(P>0.05);MGMT表达阳性患者生存时间低于表达阴性患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论MGMT在脑胶质瘤的表达与肿瘤病理级别无关,MGMT的表达可作为判断预后的指标。