关爱儿童呼吸健康, 从早期诊断开始——访上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科主任潘秋辉教授

引起呼吸道感染的病原体种类繁多,由于临床症状缺乏特异性,给疾病的诊断带来了一定的困难,因此,呼吸道感染早期精确诊断就显得尤为重要。正值多种呼吸道疾病叠加流行的冬季,中华医学会《健康世界》邀请上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科主任潘秋辉教授,从呼吸道感染早期诊断作为切入点,向我们介绍呼吸道病原体检测技术,加强对疾病本质的认识,增强自我防护意识,掌握防护技能,远离呼吸道感染。

骨形态发生蛋白2通过Smad途径上调Osterix的表达

Osterix(Osx)是一种重要的调控成骨细胞分化的具有锌指结构的转录因子.骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP 2)能够上调Osx的表达,但其分子机制并不清楚.采用实时定量RT-PCR方法检测到BMP2诱导成骨相关细胞C3H10T1/2,MC3T3-E1,C2C12中Osx的转录水平显著上调,并且与成骨分化指标Col1a1,osteocalcin具有相似的表达动力学特征.而且,在C3H10T1/2细胞中过表达负显性(dominant negative,DN)Osx基因,能够有效抑制BMP2诱导的成骨分化.过表达BMP/Smad信号通路抑制蛋白Smad6,能够抑制Osx转录水平的上调.但是通过荧光素酶报告载体对Osx的启动子-1254^+85区域进行分析后未发现接受BMP通路调控的启动子区域.上述结果表明,BMP2能够通过Smad途径上调Osx的表达,并对成骨分化的过程具有十分重要的作用.

双龙接骨丸含药血清促进成骨细胞的增殖及其分子机制的研究

目的在体外研究骨伤药双龙接骨丸含药血清对成骨细胞增殖活动的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法制备双龙接骨丸含药血清,MTT 法观察体外含药血清对成骨细胞株 HFOB 1.19的促增殖作用,cDNA 微阵列技术分析含药血清导致的基因表达差异,寻找双龙接骨丸的可能作用途径。结果高、中、低剂量双龙接骨丸含药血清组较对照组均有明显促进 HFOB 1.19增殖的作用(P<0.01),此过程中至少有8种基因的表达量发生明显变化,其中 cAMP 依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKAP Ⅰβ)表达量上调1.8倍,GC 盒结合蛋白表达降低73%。结论初步判定双龙接骨丸含药血清在体外有促进人成骨细胞增殖的作用,并有可能是通过 cAMP 介导的信号传导途径进行的。

BMP2/7异源二聚体调控CIZ的表达与自身活性的关系

BMP2/7异源二聚体的活性显著高于BMP2同源二聚体,但其机制并不清楚。采用哺乳动物细胞表达的BMP2/7异源二聚体处理成骨细胞MC3T3-E1,细胞化学染色发现BMP2/7的活性显著高于BMP2,报告载体p3GC2-LUX检测发现BMP2/7能够明显上调BMP/Smad通路的活性(P<0.05)。但在成骨细胞中过表达CIZ(casinteracting zinc finger protein),能够显著抑制BMP2/7上调ALP与Osteocalcin的作用,并阻断BMP2/7对BMP/Smad通路的激活。同时发现BMP蛋白能够上调CIZ的表达,但BMP2/7的作用明显低于BMP2同源二聚体。可以认为BMP2/7能够诱导CIZ的表达,但由于作用较弱,所以对自身活性的反馈抑制作用也较弱,这可能是BMP2/7有着较强生物活性的关键所在。

转录因子Osterix对成骨细胞Col1a1基因的反式激活作用

Osterix(Osx)是一种具有锌指结构的转录因子,对骨形成十分重要.但到目前为止,直接接受Osterix调控的靶基因尚不清楚.用骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导原代培养小鼠成骨细胞的骨分化,定量RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ a1,Col1a1)与Osx的转录水平.结果发现,二者的转录时相具有相同的变化模式.为了确定二者之间的关系,采用腺病毒表达系统在原代成骨细胞中过表达Osx.数据表明,Osx能够明显上调Col1a1的转录水平.用EMSA(electromobility shift assay)检测这些过表达Osx基因的成骨细胞核抽提物,迁移条带的出现表明,Osx能够直接与Col1a1的启动子相结合.结果提示,在原代培养的成骨细胞中,Osterix通过直接与启动子相结合,调控Col1a1基因的转录.

一种有效提高纳豆激酶表达量的方法

为提高纳豆激酶在大肠杆菌中的表达量 ,在不改变蛋白质序列的前提下 ,对纳豆激酶氨基端编码前 2 0个氨基酸的序列进行改造 ,以降低此区域的GC含量及稀有密码子数量 ,其中有 3个位点直接采用T ,另有 4个位点采取不确定突变的方式 ,产生 1 6种组合 ,由此而得 1 6条序列 ,利用生物信息软件DNASISv2 5对这些序列的二级结构进行模拟 ,取得自由能绝对值最低的 6条序列设计引物 ,克隆至表达载体pET 3c,导入大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,其中有 3株菌形成明显高效表达。

在CHO细胞中表达具有高效成骨活性的BMP-2／7异源二聚体

PCR扩增BMP-2与BMP-7的编码基因,利用重叠PCR以柔性肽(Gly4Ser)5编码序列将二者串连并克隆到质粒pIRESneo3上,转染CHO-K1细胞得到混合稳定克隆。ELISA检测培养液中BMP-2/7异源二聚体蛋白的表达水平为230.75±13.34ng/mL,以此为条件培养基处理成骨细胞株MC3T3,对照组为分别含有CHO-K1细胞及大肠杆菌表达的BMP-2同源二聚体以及PBS的条件培养基。结果发现碱性磷酸酶染色与茜素红染色差异明显,定量RT-PCR显示分子指标OC、ALP、Runx2与Osx的转录水平明显增高(P<0.05),Luciferase报告基因检测BMP/Smad通路活性较对照组升高明显(P<0.05)。首次设计构建了BMP-2/7异源二聚体蛋白,其成骨活性显著高于BMP-2同源二聚体。

中医消除运动性肌肉疲劳临床实验研究之一——外用、内服中药对人体骨骼肌两周离心运动肌肉酸痛和形态学影响

30名志愿受试者分别以最大等长收缩力的 6 0 % (第 1周 )和 80 % (第 2周 )完成连续 2周上臂屈肌离心收缩训练 ,随机分成中药内服、外用和对照组进行治疗和处理 ,对肌肉酸痛部位和等级、肘关节屈曲角度、肘关节伸直角度、上臂臂围、上臂屈肌硬度、血清CK以及肱二头肌回声的平均光密度和肌肉厚度超声检测进行观测。结果显示 ,强度增加后的第 2周 ,肌肉酸痛程度、肘关节伸直角度和血清CK值在实验结束时均已恢复正常 ;肘关节屈曲角度、上臂臂围和肌肉硬度等与延迟性肌肉酸痛 (DOMS)后期肌肉增粗有关的指标 ,在第 2周训练强度增加后呈恢复趋势 ,无继续加重现象 ;大强度离心训练后肌肉厚度增加 ,训练后第 3天出现肌肉回声增强的改变。实验表明 ,内服和外用中药对DOMS的消除均有一定的作用 。

中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定

【目的】克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子。【方法】从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoRⅠ位点,将PSMA分成两段分别做RT-PCR,然后再将其分别连接到pET-30(a)中,从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,并对其进行鉴定。【结果】首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA,并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础。【结论】分段克隆基因,然后将基因分别连接到同一载体,是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一。

牛膝促进成骨细胞增殖的作用与机理研究

目的 :研究牛膝对成骨细胞株HFOB1 19的促增殖作用及其分子机制。方法 :制备牛膝含药血清 ,醇提法制备牛膝脱皮甾酮 ,MTT法检测二者对体外培养的HFOB1 19的促增殖作用 ,RT PCR检测PKARⅠ β的表达。结果 :牛膝含药血清与牛膝脱皮甾酮均能促进成骨细胞的增殖 ,并导致PKARⅠ β表达的上调。结果 :初步判定牛膝在体外有促进人成骨细胞增殖的作用 ,其主要作用成份为脱皮甾酮 ,并有可能是通过cAMP介导的信号传导途径进行的。

糖化血红蛋白及糖化白蛋白在妊娠期糖尿病诊断中的价值

目的：评估糖化血红蛋白（HbA1 c ）和血清糖化白蛋白（GA）在妊娠期糖尿病（GDM）患者早期监测中的作用。方法根据美国糖尿病协会（ADA）建议，以口服75 g葡萄糖耐量试验（OGTT）测定值作为诊断GDM的标准，将98例妊娠妇女（孕期22～24周）分为正常妊娠组50例、GDM组48例，同时测定2组的HbA1 c和GA，并进行统计学分析及受试者工作特征（ROC ）曲线分析。结果 GDM组的HbA1 c和GA明显高于正常妊娠组（P＜0．01）。当HbA1c的Cut-off值为5．15％时，ROC 曲线下面积为0．954＆#177;0．020，敏感性为87．5％，特异性为92．0％。当GA的Cut-off值12．50％时，ROC曲线下面积为0．910＆#177;0．029，敏感性为81．3％，特异性为84．0％。HbA1c和GA联合诊断GDM的敏感性为70．8％、特异性为98．0％。结论当HbA1c ＞5．15％和GA＞12．50％时，诊断GDM的敏感度和特异性较高。HbA1 c和GA联合检测对GDM有重要价值。

抗EB病毒衣壳抗原IgG抗体亲合力诊断儿童传染性单核细胞增多症的价值及患儿免疫状态的变化

目的探讨抗EB病毒衣壳抗原(EBV-CA)IgG抗体亲合力对EB病毒(EBV)感染传染性单核细胞增多症(IM)的诊断价值及患儿免疫状态的变化。方法选取行抗EBV-CAIgG抗体亲合力及抗EBV-CAIgM抗体检测的儿童5882例,其中IM500例、非IM5382例,检测抗EBV-CAIgG抗体亲合力、抗EBV-CAIgM抗体、EBVDNA载量、外周血异型淋巴细胞(简称异淋)比例和外周血淋巴细胞亚群。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价抗EBV-CAIgG抗体亲合力、抗EBV-CAIgM抗体、异淋比例和EBVDNA单项及联合检测诊断IM的效能,并观察IM患儿的免疫状态。另选取临床诊断为IM并检测EBVDNA和淋巴细胞亚群的患儿502例,探讨EBVDNA阳性及阴性IM患儿的细胞免疫状况。结果在5882例儿童中,抗EBV-CAIgG抗体亲合力、抗EBV-CAIgM抗体、EBVDNA和异淋比例4项指标任意1项阳性的患儿为1031例(17.53%),其中IM的发生率最高(38.1%)。ROC曲线分析结果显示,抗EBV-CAIgG抗体亲合力、抗EBV-CAIgM抗体、异淋比例和EBVDNA诊断IM的曲线下面积(AUC)分别为0.883、0.729、0.788和0.664,4项指标联合检测的AUC为0.847。依据年龄将1031例患儿分为婴儿组(<1岁)、幼儿组(1~3岁)、学龄前期组(4~6岁)和学龄期组(7~17岁)。除婴儿组外,其他3组中的IM患儿CD3-CD16+CD56+自然杀伤(NK)细胞比例、CD3-CD19+B细胞比例、CD3+CD4+T细胞比例及CD4+/CD8+比值显著低于非IM患儿(P<0.01),CD3+T细胞比例、CD3+CD8+T细胞比例显著高于非IM患儿(P<0.01)。婴儿组中的IM患儿CD3-CD19+B细胞比例显著低于非IM患儿(P<0.01),CD3+T细胞、CD3+CD8+T细胞比例显著高于非IM患儿(P<0.01),而CD3-CD16+CD56+自然杀伤(NK)细胞比例、CD3+CD4+T细胞比例、CD4+/CD8+比值IM患儿与非IM患儿之间差异无统计学意义(P>0.05)。EBVDNA阳性IM患儿与阴性IM患儿比较,上述变化更明显。结论抗EBV-CAIgG抗体亲合力对IM的诊断价值优于异淋比例、抗EBV-CAIgM抗体和EBVDNA。IM患儿细胞免疫功能明显紊乱,EBVDNA阳性的IM患儿紊乱程度更严重。

血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化

【目的】研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43(Cx43)表达的变化及与细胞周期分布的关系。【方法】分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大,72h后用RT-PCR和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达,用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及Cx43表达量的关系。【结果】血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强,S期、G2-M期细胞百分比增加,细胞内G2-M(二倍体)DNA含量降低,Cx43蛋白表达低于对照组,Cx43mRNA表达水平也较对照组明显下调,Cx43蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。【结论】血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因表达明显下调,导致Cx43蛋白表达亦出现下调,这一改变可能与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关,提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程,而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。

骨形态发生蛋白2诱导C2C12和MC3T3-E1的成骨分化与自噬

背景:一系列研究表明自噬与分化有密切联系;骨形态发生蛋白2是诱导C2C12、MC3T3-E1成骨分化经典途径,是研究成骨分化过程的理想模型。目的:观察自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化的关系。方法:Real-Time PCR检测MC3T3-E1与C2C12在骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导培养3 d后成骨与自噬相关指标变化。碱性磷酸酶染色检测不同浓度3-甲基腺嘌呤(0,1,5,10 mmol/L)对骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导培养7 d MC3T3-E1与C2C12成骨指标碱性磷酸酶变化,Western Blot检测C2C12和MC3T3-E1在骨形态发生蛋白2(100μg/L)诱导不同时间点(0,12,24,48,72,96 h)LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平。结果与结论:在骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程中,诱导自噬相关mRNA与蛋白水平均有增高趋势,且自噬相关蛋白LC3水平增高与时间相关。同时,抑制自噬成骨分化过程中碱性磷酸酶表达水平降低。因此,自噬与骨形态发生蛋白2诱导细胞株C2C12、MC3T3-E1成骨分化过程有密切关系。

骨形态发生蛋白2诱导成骨分化与长链非编码RNA AK007000的影响

背景:长链非编码RNA调控一系列生理过程,被认为在发育、分化和代谢的基因调控中发挥重要的作用。MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞可向骨细胞、肌细胞等多个方向分化,用于肌肉骨骼等运动系统相关疾病的研究。目的:观察长链非编码RNA在骨形态发生蛋白2诱导成骨分化中的作用。方法:对MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下,成骨分化过程中的长链非编码RNA表达变化进行芯片分析,找到在3株细胞中同时变化的长链非编码RNA,siRNA干扰方法观察长链非编码RNA对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响,采用Real-Time PCR与碱性磷酸酶染色检测成骨相关指标。结果与结论:骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2成骨分化过程中,相应成骨指标增高,成肌指标肌细胞生成素降低。筛选出骨形态发生蛋白2诱导成骨分化过程中出发挥作用的长链非编码RNA AK007000。AK007000被干扰后成骨分化指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7表达下降,肌细胞生成素表达上升。因此,AK007000可能具有促进成骨抑制成肌作用。

甘精胰岛素和人胰岛素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖作用

目的探讨甘精胰岛素(insulin glargine)和人胰岛素(human insulin)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响及细胞外信号调节激酶(ERK)的调节作用。方法使用不同浓度的甘精胰岛素和人胰岛素刺激人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,检测不同时间段的细胞增殖作用,探讨抑制ERK1/2激活对细胞增殖的影响。使用cell counting kit-8(CCK-8)试剂检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布。结果甘精胰岛素和人胰岛素在1、10、100IU.L-1刺激MDA-MB-231细胞96h后均可轻度促进MDA-MB-231细胞增殖,相同条件下甘精胰岛素和人胰岛素的促增殖效应无差异。甘精胰岛素与人胰岛素以10IU.L-1分别刺激48、72、96h后两药均诱导细胞增殖,比较两种药物间增殖效应的差异无统计学意义。甘精胰岛素和人胰岛素均使S+G2/M期细胞比例增加,但两处理组间差异无显著性。ERK1/2抑制剂PD98059可抑制MDA-MB-231细胞增殖;但PD98059不影响甘精胰岛素和人胰岛素对MDA-MB-231细胞增殖的促进作用。结论甘精胰岛素和人胰岛素对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖有类似的轻度促进作用,该作用不依赖于ERK的激活。

裸鼠人绿色荧光子宫内膜异位症模型的构建

【目的】探索建立人子宫内膜异位症荧光体外与在体模型的具体方法。【方法】采用增强型绿色荧光蛋白腺病毒(Ad-eGFP)分别转染原代培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞(细胞转染注射法,即方法1)和子宫内膜组织块(组织转染注射法,即方法2),比较两种体外转染的差异;然后采用方法1将绿色荧光腺病毒转染后的腺上皮细胞和基质细胞注入裸鼠皮下形成荧光病灶,并且与方法2相比较,观察直至建模后25d,计算病灶荧光成模率与病灶荧光存在时间,并给予组织鉴定。【结果】方法1与2建模后5d两种方法病灶荧光阳性率分别达88.9%和22.2%,P=0.015;病灶体外荧光存在时间分别为(12±8)d与(7±4)d。病理组织学HE染色和免疫荧光共同鉴定显示病灶来源于人子宫内膜。【结论】应用Ad-eGFP转染后人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞混悬液注射可成功建立裸鼠皮下人子宫内膜异位症活体荧光观察模型,同时方法成模率高,体外荧光存在时间较长。

骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中长链非编码RNA的作用

背景:人类长链非编码RNA是现今的研究热点,已有研究报道其在肿瘤发生中的作用机制,但其在成骨分化方面的机制并不明确。目的:观察人类长链非编码RNA在经骨形态发生蛋白2诱导小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用,并探讨其分子机制。方法:首先进行碱性磷酸酶染色和成骨指标基因检测。对C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下的成骨分化过程长链非编码RNA表达变化进行芯片分析。采用高通量测序比较骨形态发生蛋白2诱导组和未经骨形态发生蛋白2诱导组的表达变化,筛选出表达下降的基因。过表达相应长链非编码RNA后观察对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响。结果与结论:骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞导致碱性磷酸酶活性增加。骨形态发生蛋白2诱导72 h后,碱性磷酸酶、Id1、骨钙素、Runx2、sp7表达上升(P<0.05)。未诱导C3H10T1/2细胞与骨形态发生蛋白2诱导细胞芯片杂交后结果比较,下降达1.5倍的长链非编码RNAs有24条,其中只有AK035085有内含子。与未过表达AK035085的对照组相比,骨形态发生蛋白2诱导72 h后AK035085过表达的C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶、Id1、骨钙素、Runx2、sp7表达均下降(P<0.05)。提示骨形态发生蛋白2可刺激C3H10T1/2细胞发生成骨分化,AK035085可能对C3H10T1/2细胞的成骨分化存在抑制作用。

TNF-α对肾脏近端小管上皮细胞caspase-3的调控作用及其机制

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对大鼠原代肾小管上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)激活与表达的调控以及核因子-κB(NF-κB)在其中的作用。方法:体外分离与培养大鼠肾小管上皮细胞,以TNF-α(10μg/L)按不同时间给予刺激,Western blotting检测caspase-3及其活化裂解片段cleaved caspase-3,以及I-κBα和磷酸化I-κBα(pI-κBα)蛋白水平。分别以TNF-α(10μg/L)处理24h、NF-κB特异性抑制剂Bay11-7082(5μmol/L)处理25h、Bay11-7082(5μmol/L)预处理1h后加入TNF-α(10μg/L)刺激24h,检测caspase-3及cleaved caspase-3的变化。结果:TNF-α刺激6至24h,cleaved caspase-3与caspase-3的相对比值显著高于对照组;而caspase-3蛋白水平在TNF-α刺激后6h无明显增高,12h低于对照组,24h回升;Bay11-7082处理组和Bay11-7082+TNF-α处理组的caspase-3蛋白表达与活化水平显著低于TNF-α处理组和对照组。结论:TNF-α促进大鼠原代肾小管上皮细胞caspase-3的激活与表达,这一过程与NF-κB的激活有关。

使用一种新策略在大肠杆菌中高效表达hbFGF(英文)

翻译起始区 (TIR)的二级结构是影响翻译效率的决定性因素 ,同时密码子的偏好性问题也是个至关重要的方面。基于以上两点考虑 ,对hbFGF 5’末端 35个碱基进行了改造 ,对其中 4个位点进行了定点突变 ,另有 4个位点进行了随机点突变。这些突变都可能造成TIR二级结构变化。这 4个随机突变共有 32种组合 ,使用RNA结构预测软件DNASISv2 .5对这 32种序列分别模拟其二级结构且计算其自由能 ,并选取了 10条自由能最高的序列。根据这10条序列 ,分别设计引物引入突变 ,克隆至表达载体pET 3c上 ,然后转化宿主菌E .coli,通过诱导表达纯化及生物测活等常规实验方法 ,最后确定有两株为高表达菌株 ,从某种程度上证明了用计算机辅助设计定点突变的方法来优化外源基因在E .coli中的表达是有效且很有潜力的。