基于血凝素蛋白特异性抗体的H7亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法建立

目的基于H7亚型流感病毒,制备针对于HA抗原的单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测体系,为其在流感病毒快速检测试剂研发中提供技术储备。方法用H7亚型禽流感病毒HA重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤技术制备HA特异性单克隆抗体,筛选可在双抗体夹心ELISA技术平台上使用的配对抗体,初步探索该ELISA体系的检测特异性、敏感性和广谱性。结果共制备出6株HA特异性单克隆抗体,并成功筛选出捕获抗体8B11-C9及检测抗体7C3-G5的最佳配对。该双抗体夹心体系对HA重组蛋白的检测灵敏度可达到1.56 ng/mL,能有效检测出不同宿主来源的H7亚型流感病毒,与其他亚型流感病毒无交叉。结论成功制备出H7亚型流感病毒HA单克隆抗体,建立了H7亚型流感病毒特异性的双抗体夹心ELISA检测方法,为其快速检测试剂研发奠定了基础。

基于贝氏柯克斯体急性期抗原A的间接ELISA方法建立及应用

为开发快速有效的Q热血清学诊断技术,以贝氏柯克斯体急性期抗原A(acute disease antigen A,AdaA)为诊断靶标分子,构建了基于该重组抗原的间接ELISA方法,完成了来自福建某牛场的200份临床牛血清样本检测,并对检测结果进行了评估。结果表明:以商品化ELISA试剂盒ID Screen■Q热为金标准,建立的间接ELISA检测特异性为94.4%(152/161),检测敏感性为84.6%(33/39),与感染牛的常见病原体如衣原体、布氏杆菌、副结核杆菌无交叉。应用该诊断方法检测发现,福建某牛场约有21%(42/200)的牛为Q热阳性。该结果证实,基于AdaA的间接ELISA方法具有较高的特异性及敏感性,有良好的应用价值,可以用于牛Q热的血清学监测。

单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文)

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子.

人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg抗体片段并进行初步鉴定。方法收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库。以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定。结果构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性。经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3和hFabHB4。对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性。结论成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链(CDR3)_6基因的构建表达及初步鉴定

目的设计、构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链(H链)CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6,并对表达产物进行初步鉴定。方法克隆NP30H链(CDR3)6基因,导入PET-28(a)载体并在E.coliBL21中表达;表达产物经纯化后用ELISA方法测定活性。结果(CDR3)6基因被成功构建、表达,表达产物经ELISA检测证实其可与抗NP30抗体NP48及日本血吸虫病人血清反应。结论(CDR3)6部分保留了抗独特型抗体表位的亲和性和特异性。

抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化

目的:优化抗HBsAg人源抗体片段hFabHB1在大肠杆菌中功能性表达的条件。方法:通过测定宿主菌培养物A600值观察10g/L的葡萄糖对宿主菌生长的影响;比较诱导前是否更换培养液的2种不同条件hFabHB1的表达产量;比较在37℃和25℃2种诱导温度下功能性hFabHB1分子的表达量以及Fd和轻链表达的平衡性。大量表达的功能性hFab-HB1分子经亲和层析纯化后,用ELISA鉴定其生物活性。结果:在培养液中加入10g/L的葡萄糖可有效抑制重组蛋白的本底表达,增加宿主菌的生长速度;在加入IPTG诱导前更换培养液可明显提高hFabHB1的表达产量;25℃的诱导温度比37℃能表达更多的功能性Fab分子,并且Fd和轻链表达量也更趋于平衡。经亲和层析纯化的hFabHB1分子可与HBsAg特异性结合。结论:实验结果为在原核系统中大量表达该抗体片段提供了技术储备。

利用JET引擎存取数据库的分析

本文分析了在VB4.0中，利用JET引擎存取数据库的一般机制，重点对ODBC数据源的存取进行了举例说明。

浮动工具箱编程技术

浮动工具箱是当今流行软件所具有的一大特色，本文介绍了编制浮动工具箱所要解决的技术要点，最后给出了一人在ＡｕｔｏＣＡＤ１２。０ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ中实现浮动工具箱的例子。

20例人感染新型布尼亚病毒病的临床和流行病学特征分析

目的分析人感染新型布尼亚病毒病的临床特点和流行病学特征,为制定预防控制措施提供依据。方法采用统一的诊断标准和流行病学个案调查表对病例进行调查。结果 2010年江苏省境内报告的33例疑似病例中有20例确诊人感染新型布尼亚病毒病,病死率为30%。临床表现主要为发热(100%)、乏力(80%)、畏寒和呕吐(60%);血常规检查有血小板计数减少(100%)和白细胞计数减少(90%);病例多来自丘陵地区,以男性、中老年、农民为主,发病时间呈两个高峰,分别为6～7月和9～10月,部分病例发病前有明确的蜱叮咬史。结论 SFTS病例发病初期临床症状不典型,发病有地域特征,散发病例多见,但不排除人与人传播的可能。

利用构件对象模型实现应用间的互操作

重点从编程的角度讨论了构件对象模型ＣＯＭ中的重要功能

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,并探讨其在该病诊断中的作用。方法克隆NP基因,构建原核表达载体pComb3XSS-NP,并转化大肠杆菌Top10F′,经诱导表达,纯化获得6HIS-NP融合蛋白。以该融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术制备NP的鼠源单克隆抗体。经鉴定后,选择1株1C8-C6进行大量制备、纯化,并偶联辣根过氧化物酶(HRP),用该酶标抗体对SFTSV感染人的急性期血清进行Western blot检测。结果成功表达、纯化SFTSV重组的NP。经小鼠免疫、细胞融合和ELISA筛选后,共获得4株鼠源单克隆抗体。具较高滴度的1C8-C6酶标抗体能与SFTSV感染人的急性期血清中的NP在Western blot水平上结合,而与汉坦病毒、登革热病毒感染人急性期血清及正常人血清不反应。结论 SFTSV NP的表达及其单抗的制备为该病的实验室诊断奠定了基础。

高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析

目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。结果经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中,经诱导表达、SDS-PAGE和Westernblotting分析,在相对分子质量30000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力(Kd值为5.24×10-6mol/L)相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。结论经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.

抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。

2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查

目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果采集761只（管）动物,43只（管）检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65%。采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%）,蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23%,不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介。

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.

Windows ADS应用程序接口文件分析与应用

本文首先介绍了在Windows环境下用C语言开发AutoCAD 12.0 ADS应用程序所需要的接口文件,然后概述其应用及编程要点,最后重点介绍了一个“浮动工具箱”的例子。

柔嫩艾美尔球虫T细胞刺激性抗原的免疫原性

以抗原对脾脏和盲肠扁桃体 T细胞的刺激能力和动物保护性试验为指标观察了柔嫩艾美尔球虫 ( Eimeriatenella)孢子化卵囊可溶性抗原及其组分的免疫保护作用。纯化的孢子化卵囊经超声波粉碎 ,获得全可溶性抗原 ,用Sephadex G- 2 0 0凝胶过滤层析后 ,获得 4个组分 ,分别命名为 1 .0蛋白、2 .0蛋白、3 .0蛋白和 4 .0蛋白。可溶性抗原及其各个组分 ,均能刺激球虫耐过鸡脾脏和盲肠扁桃体 T细胞增殖 ,其中以 3 .0蛋白作用最强。 3 .0蛋白再用Sephadex G- 75凝胶过滤层析 ,获得 3 .1蛋白、3 .2蛋白和 3 .3蛋白组分。其中 3 .2蛋白对脾脏和盲肠扁桃体 T细胞刺激作用最强。SDS- PAGE电泳显示 ,3 .2蛋白含有 2条多肽 ,相对分子质量分别约为 3 70 0 0和 4 0 0 0 0。动物免疫保护性试验表明 ,3 .2蛋白可以有效保护感染鸡抵抗柔嫩艾美尔球虫的攻击 ,盲肠病变计分为 1 .5 ,增重与不免疫不攻虫对照组相当 ,表明 3 .

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)人源性单链抗体文库的构建

目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。