miR-375靶向PI3K/AKT通路在高糖诱导的人视网膜内皮细胞增殖和血管生成中的作用

目的探讨miR-375靶向磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对高糖诱导的人视网膜内皮细胞(hRECs)增殖和血管生成的影响机制。方法体外培养hRECs,对hRECs进行转染及双荧光素酶检测。hRECs分为对照组、高糖组、高糖+miR-375组、高糖+miR-375+LM22B-10组。采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用血管形成实验检测细胞血管形成能力,采用RT-qPCR检测hRECs内miR-375和PI3K mRNA的表达情况,采用Western blot检测hRECs内PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达的情况。结果与对照组比较,高糖组、高糖+miR-375组、高糖+miR-375+LM22B-10组培养48 h和72 h时hRECs增殖活力、PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达水平、血管形成能力和PI3K mRNA表达均显著升高,而miR-375表达降低(均为P<0.05);与高糖组比较,高糖+miR-375组培养48 h和72 h时hRECs增殖活力、PI3K mRNA和蛋白以及p-AKT/AKT的蛋白表达水平、血管形成能力均降低,而miR-375表达升高(均为P<0.05);与高糖+miR-375组比较,高糖+miR-375+LM22B-10组培养48 h和72 h时hRECs增殖活力、血管形成能力和p-AKT/AKT蛋白表达水平均升高(均为P<0.05),而miR-375、PI3K mRNA差异均无统计学意义(均为P>0.05)。转染miR-375模拟物和PI3K野生型载体后,hRECs中相对荧光素酶活性分别较转染miR-375阴性对照、转染PI3K突变型载体后显著降低(均为P<0.05)。结论miR-375靶向抑制PI3K/AKT通路可抑制高糖诱导的hRECs增殖和血管生成,进而缓解DR。

不同尿液标本采集方法对尿沉渣分析仪诊断尿路感染的价值

目的探索Sysmex UF-1000i尿沉渣分析仪定量检测结果中细菌和白细胞计数在诊断尿路感染中的价值,阐明标本采集送检的不同对UF-1000i诊断尿路感染的影响。方法选取笔者医院2015年7月~2015年8月466例怀疑尿路感染的入院患者同时做细菌培养及尿常规的检验结果(A组标本),收集2016年3月下旬~4月上旬148例尿细菌培养清洁中段尿标本,接种之后立即送检尿常规检查(B组标本)。取两组标本的细菌及白细胞计数结果,以细菌培养为金标准用SPSS 18.0统计软件分别绘制ROC曲线,求出尿沉渣细菌和白细胞计数诊断尿路感染的阈值,并计算其敏感度、特异性、阳/阴性预测值、假阳性/假阴性率和准确性,比较两组标本的各项指标。结果尿沉渣细菌与白细胞定量检测最佳阈值,A组标本分别为101.7/μl与18.8/μl,B组标本分别为98.7/μl与11.1/μl。尿沉渣细菌与白细胞ROC曲线下面积,A组标本分别为0.604与0.661,B组标本分别为0.941与0.848。对B组标本而言,细菌与白细胞联合诊断尿路感染最佳敏感度为82.4%,特异性为92.1%,阳性预测值为77.8%,阴性预测值为93.8%,假阳性率为7.9%,假阴性率为17.6%,准确度为89.9%,并可将细菌培养降低70.9%。结论 UF-1000i尿液沉渣分析仪在诊断尿路感染中有早期筛选,辅助诊断的价值。标本达到无菌采集、中段尿并在2h内送检的要求才能使UF-1000i发挥最大价值。

肺炎链球菌毒力基因表达差异性及对大环内酯类耐药性分析

目的探讨临床分离各表型肺炎链球菌毒力基因表达的差异性并分析其对青霉素和大环内酯类抗菌药物的耐药性.方法收集2012年12月-2016年12月不同来源的肺炎链球菌111株,分为侵袭性组和非侵袭性组,采用荚膜肿胀实验进行血清学分型,聚合酶链反应(PCR)和荧光定量PCR检测psaA、ply、lytA、cbpA、nanA毒力基因,最低抑菌浓度(MIC)法检测药物敏感性并用PCR检测相关耐药基因(PBP1A、PBP2B、PBP2X,er-mB、mefA).结果111株肺炎链球菌共检出24个血清型/群,流行血清型为:19F、19A、14、23F、6A、6B.所有菌株5个毒力基因的携带率基本均接近100%;侵袭性菌株nanA、lytA、psaA、ply 4个毒力基因在转录水平高于非侵袭性菌株,此外19F和6A/B血清型中侵袭性菌株这4个毒力基因转录水平也高于非侵袭性组;nanA、psaA、cbpA和ply在3型中的转录水平高于其他血清型.血液与痰液标本来源的肺炎链球菌毒力基因转录水平有一定差异但无统计学意义,脑脊液来源与血液,痰液比较,转录水平增高;脑膜炎肺炎链球菌青霉素非敏感率为70.00%(7/10),非脑膜炎肺炎链球菌青霉素非敏感率为18.81%(19/101),90.09%(100/111)菌株同时对红霉素和克林霉素耐药,主要携带ermB基因.结论常见5种毒力基因在肺炎链球菌中普遍存在,但不同致病类型、不同血清型和不同来源菌株基因表达水平存在差异,侵袭性3型和脑脊液来源的菌株毒力较强,且该地区肺炎链球菌对青霉素、红霉素和克林霉素耐药率较高,尤其是脑膜炎肺炎链球菌,应引起临床重视.

重组轮状病毒NSP4蛋白对大鼠神经元细胞内钙离子的干扰及损伤作用

目的研究轮状病毒非结构蛋白4的86～175位氨基酸肽段（amino acid residues86to 175 of nonstructural protein4，NSP486-175）对大鼠神经元细胞内钙离子的干扰及损伤作用。方法利用前期制备好的活性NSP486-175蛋白处理原代培养的大鼠神经元细胞，观察蛋白质处理后细胞的形态变化，检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性；Fluo-3AM标记细胞内游离的钙离子．蛋白质处理细胞后，用激光共聚焦显微镜检测神经元细胞内钙离子浓度变化。结果正常生长的神经元细胞胞体丰满，呈不规则形或梭形，细胞突起数量较多并且较长，纯化的NSP4 86-175 蛋白刺激后的大鼠神经元细胞出现明显的细胞病变效应，细胞密度稀疏，细胞胞体皱缩，细胞突起数量减少；蛋白质处理组细胞培养液中的LDH活性均增大；外源性添加NSP4 86-175 能引起神经元细胞内荧光强度和分布改变。结论NSP4 86-175 对大鼠神经元细胞具有损伤作用，这可能与它导致细胞内钙库释放引起的钙离子浓度升高有关，为轮状病毒肠道外播散感染和致病提供了一定的理论依据。

温州地区2014年-2016年儿童腹泻病毒感染流行情况调查

目的调查分析温州地区儿童腹泻病毒感染流行状况。方法收集2014年-2016年温州医科大学附属第二医院腹泻患儿粪便标本7 138份,采用免疫荧光法快速检测轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒和星状病毒的相关抗原。结果轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒和星状病毒阳性率分别为22.67%、1.23%、0.07%和0.08%,其中混合感染6例;轮状病毒阳性构成比为94.23%,其他3种共占5.77%;轮状病毒2014年-2016年阳性率分别为24.02%、22.54%和21.45%;>6个月~2岁儿童占轮状病毒腹泻发病率的85.94%,且>1岁~2岁腹泻患儿阳性检出率最高,为29.34%;轮状病毒感染集中在1月-3月和11月-12月,其中12月和1月高达40%以上。结论在温州地区儿童主要以单一感染轮状病毒为主,感染率较稳定,6个月~2岁儿童是高危人群,以春冬为高发期,主要为偶发感染其他腹泻病毒以及混合感染。

T细胞免疫检测在肺结核鉴别诊断中的应用

目的评估结核感染T细胞免疫检测（IGRA/ELISA法）用于在肺部感染患者中鉴别诊断结核病的效能。方法选取肺部感染患者106例,根据结核诊断标准确诊30例为结核感染,76例为非结核感染。用IGRA/ELISA法检测患者血液中经结核特异性抗原刺激后的淋巴细胞释放的IFN-γ含量,比较两组IFN-γ含量的差异;绘制ROC曲线并分析AUC和最佳截断值及最佳界点处的敏感度、特异度和约登指数。结果结核组IFN-γ浓度均值为（329.72±31.03）pg/mL,非肺结核组为（52.77±12.08）pg/mL,t=8.318,P〈0.001。ROC曲线下面积AUC=0.934（95%CI,0.890~0.978）,当界点为59.70pg/mL时,灵敏度为100.0%,特异度为78.9%,约登指数为0.789;当界点为108.25pg/mL时,灵敏度为90.0%,特异度为84.2%,约登指数为0.742;当界点为404.00pg/mL时,灵敏度为33.3%,特异度为100.0%,约登指数为0.333。结论以IGRA/ELISA法检测IFN-γ浓度,以59.70pg/mL,108.25pg/mL,404.00pg/mL三个界点辅助临床对肺部感染鉴别诊断结核病有较好应用价值。

MALDI-TOF MS对肺炎链球菌鉴定与分型的应用

目的探讨MALDI-TOF MS对肺炎链球菌鉴定和质谱分型的应用价值。方法收集2009年1月至2013年5月温州医科大学附属第二医院临床分离的112株肺炎链球菌标本,采用Optochin敏感试验和全自动细菌分析仪对收集的菌株进行鉴定验证,并用Microflex MALDI-TOF质谱仪进行分析鉴定。根据质谱图的相似性进行细菌同源聚类树分析并构建质谱分型模型,采用荚膜肿胀试验对参与分型的菌株进行血清型比较。结果 除20株不符合检测条件之外,92株临床菌株和1株标准株经质谱分析均为肺炎链球菌,选取的60株菌株以0.5的差异水平,将60株肺炎链球菌分为18个质谱型别,在这些菌株的血清分型中有19F、19A、23F、23A、3和14六个血清型别,分布于不同的MALDI-TOF MS分型中,其中19F有18株,占30%(18/60),分布在6种不同的MALDI-TOF MS分型中,也有3型血清型较为集中地分布于相应的MALDI-TOF MS一个型别里。结论 MALDI-TOF MS能快速、准确、简便地鉴定肺炎链球菌,且能达到种的水平。对比血清型,按照0.5差异水平,建立的18个质谱分型部分的型别与血清型有一致性,但也存有差异。

高毒力肺炎克雷伯菌hfq基因缺失株的构建及其生物学特性分析

目的构建高毒力肺炎克雷伯菌NTHU-K2044菌株hfq基因缺失株(△hfq),并通过表型试验分析hfq基因对高毒力肺炎克雷伯菌生长特性、环境适应能力和毒力等生物学特性的影响。方法利用同源重组技术对NTUH-K2044菌株进行hfq基因敲除;通过表型试验,比较高毒力肺炎克雷伯菌野生株和△hfq突变株在细菌生长速度、抗环境胁迫能力、生物膜形成、荚膜形成中性粒细胞杀菌活性和大蜡螟幼虫感染致死率等方面的差异性。结果成功构建高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044△hfq缺失株,表型试验表明△hfq缺失株的生长速度显著减慢,菌落变小和超黏性下降;在pH9、pH5.5、0.7 mmol/L SDS、5%NaCl、0.1%H2O2环境和50℃高温等环境胁迫条件下,△hfq缺失株生长受到显著抑制;在毒力方面,△hfq缺失株生物膜形成能力下降,荚膜形成能力下降且荚膜合成基因magA和rmpA表达量明显下降,中性粒细胞杀菌试验存活率下降,大蜡螟幼虫致死能力显著降低。结论Hfq蛋白作为RNA伴侣分子能够参与转录后调控进而对高毒力肺炎克雷伯菌生理、环境适应性及毒力致病性具有重要的调控作用。这为寻找治疗和控制高毒力高耐药肺炎克雷伯菌新靶标提供了基础。

轮状病毒NSP486-175蛋白对大鼠心肌细胞损伤作用及相关机制研究

目的研究轮状病毒非结构蛋白4的86~175位氨基酸肽段(NSP486-175)对大鼠心肌细胞损伤作用及其相关机制。方法利用前期制备好的活性NSP486-175蛋白处理大鼠H9C2心肌细胞,观察处理后的细胞生长形态变化,检测细胞培养液中LDH活性;Fluo-3AM标记细胞内游离的钙离子,蛋白质处理细胞后,用激光共聚焦显微镜检测大鼠心肌细胞内钙离子浓度变化。流式细胞术分析蛋白质对细胞凋亡的影响,RT-PCR检测Bax、Bcl-2、caspase-3、78 kDa葡萄糖调控蛋白(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12 mRNA转录水平;Western blot检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达水平。结果正常生长的心肌细胞呈典型的成肌样细胞形态,细胞呈梭形,边界清晰。纯化的NSP486-175蛋白刺激后出现明显的细胞病变效应,细胞空泡变性,皱缩变圆,细胞碎裂;蛋白质处理组细胞培养液中的LDH活性均增高;与对照组相比,NSP486-175处理组细胞的钙离子荧光增强,细胞凋亡率增高,细胞凋亡因子caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax-2表达上调,内质网应激(ERS)经典标志分子GRP78、CHOP和caspase-12表达上调。结论NSP486-175对大鼠心肌细胞具有损伤作用,这可能与它导致细胞内钙超载,并引起内质网应激进而诱导心肌细胞凋亡坏死有关,为轮状病毒肠道外播散感染和致心肌损伤提供了一定的理论依据。