基于RNA-seq技术挖掘鹌鹑羽色自别雌雄相关基因

鹌鹑的羽色自别雌雄现象是由性染色体上的基因决定的,但具体的分子机制未知。本研究以北京白羽公鹌鹑和朝鲜栗羽母鹌鹑为研究对象,利用RNA-seq技术分析了F_(1)公鹑和F_(1)母鹑胚胎期第10天皮肤组织样品的转录组,以筛选调控鹌鹑羽色自别雌雄的关键基因,并利用qRT-PCR技术进行验证。结果表明:RNA-Seq共得到38.94 G的原始数据,平均每个样本获得了6.49 G的原始数据,6个库的Q30均在90%以上,GC含量平均值为49.7%,所测样品至少89%的reads比对到参考基因组上。通过数据库比对共得到16013个基因,其中,上调基因69个,下调基因22个。GO富集分析发现有13841个基因注释到GO数据库中,其中包含78个差异表达基因。KEGG富集结果显示,有22个差异基因富集到38条通路中。对全部差异基因进行筛选,得到了7个与羽色表型相关的基因,分别是DCT、MLANA、SLC45A2、TYRP1、TRPM1、FAM174A和KIT。qRT-PCR结果表明,候选基因均在栗羽鹌鹑中高表达,与RNA-seq结果一致,这7个候选基因可能与自别雌雄有关。

蛋用鹌鹑白羽基因座与黑羽基因座互作关系分析

为探讨蛋用鹌鹑白羽基因座与黑羽基因座互作关系,试验从纯系黑羽鹌鹑和纯系北京白羽鹌鹑中随机选取公鹑2只,母鹑6只,按照1:3比例组成黑羽(♂)与白羽(♀)正交组和白羽(♂)与黑羽(♀)反交组,并作F1代自交和回交试验,每个试验组设两个重复。结果表明,位于常染色体上控制黑羽的基因座(H/h)与位于性染色体上的白化基因座位(B/b)存在互作关系,在B/b座位白化基因b纯合时(公鹑为ZbZb,母鹑为ZbW),该基因对H/h为隐性上位,鹌鹑表现白羽。黑羽基因座(H/h)和白羽基因座(B/b)互作关系涉及两个以上基因座位间的上位作用,也涉及到性染色体与常染色体之间的基因互作,此为基因互作关系新发现,也是鹌鹑羽色遗传研究新进展,具有重要遗传学意义和实践应用价值。

蛋用鹌鹑黑羽基因座与黄羽基因座互作关系分析

试验分别从纯系黑羽鹌鹑和纯系黄羽鹌鹑中随机选取公鹑2只,母鹑6只,按照1:3比例组成黑羽(♂)×黄羽(♀)正交和黄羽(♂)×黑羽(♀)反交试验组,每个试验组各设2个杂交重复组。正交试验中各杂交组随机选取F_(1)代公鹑5只和母鹑15只组成自交组合。反交试验中各杂交组随机选取6只F_(1)代母鹑和2只亲本公鹑各组成1个回交组。观察记录并分析各试验组F_(1)和F_(2)代以及回交B_(1)代羽色及性别分离情况。结果表明,常染色体上控制黑羽性状基因座(H/h)与性染色体(Z)上黄羽基因座(Y/y)存在复杂互作关系。有色基因B存在下,黑羽基因座隐性纯合时(hh)对黄羽座位(Y/y)为隐性上位,hh与Y-(YY或Yy)互作使栗羽变为黑羽,与yy互作使黄羽变为深灰羽;黑羽座位杂合时(Hh)对Y/y为不完全显性上位,Hh与Y-(YY或Yy)互作使栗羽变为不完全黑羽,与yy互作使黄羽变为浅灰羽;黑羽座位显性纯合时(HH)与Y/y无互作关系,HH具有维持正常栗羽和黄羽表现的作用。上述两个基因座位之间互作涉及常染色体和性染色体基因座互作关系,为鹌鹑羽色研究新发现。依据研究结果,利用反交试验模式,生产具有羽色自别雌雄的杂交后代,对鹌鹑自别雌雄配套系育种和生产具有重要指导意义。

朝鲜鹌鹑GNAS基因表达、克隆及其多态性与羽色的相关性

为了研究朝鲜鹌鹑GNAS基因表达和多态性与羽色的相关性,取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑不同发育时期胚胎翅尖组织,采用Trizol法提取总RNA,实时荧光定量PCR检测GNAS基因在朝鲜鹌鹑胚胎发育不同阶段和不同羽色鹌鹑胚胎翅组织中mRNA的表达水平;克隆GNAS基因的CDS全序列并进行生物信息学分析;采集孵化至10 d胚胎翅尖组织提取基因组DNA,PCR扩增GNAS基因的特定序列,通过不对称PCR-SSCP方法结合测序确定基因型,分析不同基因型对朝鲜鹌鹑羽色形成的影响。结果表明,胚胎发育8~14 d时,GNAS基因在栗羽鹌鹑胚胎组织中的表达水平极显著(P<0.01)高于白羽鹌鹑胚胎。GNAS基因CDS区开放阅读框长1140 bp,含有14个外显子,编码含379个氨基酸的稳定性亲水蛋白。在朝鲜鹌鹑GNAS基因中检测到2个SNP位点,分别为外显子12区域的g.119221T>A和3′UTR区域的g.121181A>G。栗羽朝鲜鹌鹑的3种基因型(AA、AB和BB)的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑存在极显著差异(P<0.01)。结论表明,朝鲜鹌鹑组织中GNAS基因的表达量高低与其羽色的形成有一定的关系,GNAS基因3′UTR上的g.121181A>G位点突变与朝鲜鹌鹑羽色性状之间具有显著关联性,可作为研究朝鲜鹌鹑羽色的一个候选基因。

鹌鹑线粒体cytb基因和ND2基因的系统发育分析

为了比较朝鲜鹌鹑种内变异及其与其他物种的亲缘关系,试验分别选用黑羽、白羽、栗羽、黄羽4种羽色鹌鹑各8只,对其线粒体cytb基因和ND2基因进行PCR扩增、测序,并与其他不同鸟类的相应基因进行序列比对分析,采用最大似然法(ML)和邻接法(NJ)构建系统发育树,分析朝鲜鹌鹑的种内突变位点及与其他物种的亲缘关系。结果表明:cytb基因在4种羽色鹌鹑之间没有突变位点。ND2基因有2个突变位点,并造成氨基酸突变,即在490 bp处碱基G突变为A,导致164位点处氨基酸由缬氨酸(V)变为异亮氨酸(I),在800 bp处碱基T突变为C,导致第267位点处氨基酸由异亮氨酸(I)变为苏氨酸(T)。与朝鲜鹌鹑亲缘关系最近的是日本鹌鹑,其次是中国鹌鹑。说明线粒体cytb和ND2基因适合用于鸟类亲缘关系分析,朝鲜鹌鹑是由日本鹌鹑改良而来的。