海水养殖鲈鱼分离出一种hepcidin抗菌肽新基因

利用分子生物学技术,从我国海水养殖鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)分离到一种hepcidin抗菌肽新基因,并在国际GenBank公布(accessionnumber为AY547281).初步研究结果表明,在我国鲈鱼分离到的hepcidin基因属于hep cidin抗菌肽基因家族的新成员.

致病性鹿源坏死梭杆菌分离鉴定

应用厌氧培养技术 ,从患坏死杆菌病鹿的病变坏死组织和脓汁中分离出一种主要的病原菌 ;通过细菌形态学、染色反应、培养特性、生化试验、血清学反应等鉴定方法 ,确定该病原分离株为严格厌氧性坏死梭杆菌 ,分型鉴定为A、AB和B型 ;实验动物感染证明A和AB型坏死梭杆菌为致病性菌株。

鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB)94实验动物感染模型的建立

将坏死梭杆菌 FN( AB) 94分离株以 1 0 6、1 0 7、1 0 8、1 0 9个 /m L等不同菌量 ,于耳后根颈部皮下分别接种于 4组健康实验家兔 ,每组 3只 ,逐日观察感染家兔的发病情况。结果 ,1 0 8、1 0 9个 /m L菌量感染组家兔 ,在接种后 9～ 6 8d内先后死亡 ,6 8d死亡家兔的病理变化明显 ,并从死亡家兔内脏及脓汁中 ,应用触片及分离培养均检到长丝状及小杆状等多形态典型的坏死梭杆菌 ;1 0 7个 /m L感染家兔仅表现体重减轻 ,1 0 6个 /m L感染家兔无明显临床表现。由此表明 ,坏死梭杆菌 FN( AB) 94分离株具有很强的感染毒力 ,对家兔的最小致死量为 1 0 8个 /m L,耳后根颈部皮下接种是适宜的感染途径 。

鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB)94抗原的免疫原性

将坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94厌氧培养后 ,裂解制备抗原 ,在抗原悬液中加入等量福氏完全佐剂 ,配制成乳化抗原 ,以此分别接种 3组 9只家兔 ,并设立对照组。初次免疫后 7d进行第 2次免疫 ,每隔 1周采血 ,检测免疫兔血清中抗体滴度 ,2 8d后免疫兔分别用 2 m L 的 10 8个菌 /m L(2个 ML D)坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94感染 ,3只对照家兔同时感染相同剂量 ;逐日观察攻毒家兔的变化。结果 ,3只对照家兔于感染后的 12～ 2 1d死亡 ;而 9只免疫兔完全能抵抗毒力菌株的感染 ,6个月后仍存活。试验表明 ,坏死梭杆菌分离株 FN(AB) 94裂解抗原加佐剂后 ,具有良好的免疫原性。

腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白的基因克隆与表达

用 PCR技术从腐蹄病 E型节瘤拟杆菌克隆出具免疫保护性抗原 0 .93 kb纤毛蛋白基因 ( Pili基因 ) ,利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体。先将 PCR产物 Pili基因克隆于 TA Cloning System,扩增后 ,用Eco R 酶切 ,低熔点胶回收 ,经 Klenow补平后 ,用 T4DNA连接酶与中间载体 p PLλ连接 ,将 Pili基因克隆于 p PLλ载体 ;经 Bam H 、Bgl 、Pvu 和 Smal +Bgl 酶切鉴定和 p PLλ-Pili重组质粒 Pili基因序列测定正确后 ,扩增 p PLλ-Pili重组质粒 ,用 Bam H 酶切出 2 .1 kb大小的片段 ,回收后 ,与 p ME2 90表达质粒连接 ,转染宿主细胞 PAK/2 pfs,在营养肉汤中进行 Pili基因的表达。培养 1 8～ 2 4 h后 ,离心 ,向上清液中加入 0 .1mol/L Mg Cl2 提取重组纤毛蛋白。用羊抗兔 E型节瘤拟杆菌抗血清与提取的重组纤毛蛋白进行对流免疫电泳 ,证明重组纤毛蛋白具有特异性 ;染料结合法测定 1 0 0 0 m L上清液中表达纤毛蛋白粗含量约为 1 1 4mg。SDS-PAGE测定重组纤毛蛋白的表达量占总菌量的 1 1 .8%,Western

绵羊白细胞介素2基因的克隆与序列分析

为与腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因构建融合基因表达载体 ,利用健康绵羊血扩增和克隆了设计有特殊酶切位点的绵羊白细胞介素 2 ( Ovi IL-2 )。从绵羊血中分离白细胞 ,用 TRIZOL试剂盒提取绵羊白细胞RNA,以 RNA为模板 ,用设计的 Ovi IL-2 3′引物进行 RT-PCR,扩增 Ovi IL-2 c DNA;以 Ovi IL-2 c DNA为模板 ,用 Ovi IL-2的 5′引物和 3′引物进行 PCR,扩增设计有 Bam H 和 Eco R 限制性酶切位点的 Ovi IL-2。经1 .5%琼脂糖凝胶电泳分析和 Xba 酶切鉴定 PCR产物后 ,将 Ovi IL-2 PCR产物与质粒 p Bluescript SK( + )连接 ,进行 Ovi IL-2基因克隆 ,在含 X-gal和 IPTG的 LB平板上 ,挑选白色单一菌落进行重组质粒筛选 ,用Bam H + Eco R 或 Eco R 酶切提取重组质粒 ,琼脂糖凝胶电泳出现 1条 50 0 bp大小的带 ;用 Eco R 或Eco R + Xba ,Bam H + Xba 酶切重组质粒分别出现 2 70 bp和 2 30 bp大小的带 ,从而筛选出重组质粒p Blue-Ovi IL-2。将筛选出的 p Blue-Ovi IL-2进行序列分析 ,证明克隆的 Ovi

坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB)94免疫原对鹿的初步免疫试验

本研究将坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB) 94厌氧培养后 ,裂解制备抗原 ,与等量福氏完全佐剂混合 ,制备乳化佐剂疫苗。将疫苗分别接种 4头不同年龄的健康成年鹿 (每头接种 4ml)。 3头鹿作为对照组。接种前 ,静脉采血 ,进行对流免疫电泳检查。 30天后 ,分别用 15 0～ 40 0亿菌感染试验动物 ,然后混群饲养观察 ,并定期采血检查被免鹿血清中抗体消长变化。结果对照组鹿分别于 3个月后开始出现明显的临床症状 ,而免疫组不表现任何临床症状 ,6个月仍表现临床健康。 4头免疫鹿 6个月时都能检测到血清抗体 ,3头免疫鹿血清抗体可维持到 7个月后。试验表明 ,坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB) 94疫苗接种鹿后 ,可刺激鹿产生很好的免疫力 ,从而通过本动物初步证明坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB) 94免疫原具有良好的免疫原性 ,可以用于制备坏死杆菌病疫苗。

纤毛蛋白与绵羊白细胞介素2融合基因工程疫苗对实验动物的体液免疫应答

将转化节瘤拟杆菌 (D .nodosus)纤毛蛋白 (Pili)和绵羊白细胞介素 2 (oviIL2 )融合基因表达质粒的工程菌BL_2 1,在含梭苄青霉素营养肉汤培养基中表达 ,离心获得菌体沉淀物 ,裂解后配制成Pili_oviIL2融合基因工程疫苗。用加佐剂和不加佐剂的Pili_oviIL2融合基因工程疫苗分别接种 2只健康家兔 ,2 1天后接种第 2次 ;定期采血 ,用对流免疫电泳检测试验兔的体液免疫反应。结果发现 ,加佐剂和不加佐剂的Pili_oviIL2融合基因工程疫苗免疫兔 7天即可产生相应抗体 ,抗体在免疫血清中可维持 6个月以上。进一步试验将不加佐剂的Pili_oviIL2融合基因工程疫苗接种 3只健康绵羊 ,同样 2 1天后接种第 2次 ,定期采血 ,用对流免疫电泳检测试验绵羊的体液免疫反应。同时用Pili基因工程疫苗接种 2只绵羊作对照。结果 3只绵羊接种Pili_oviIL2融合基因工程疫苗后 ,分别于 7天和 14天产生相应的抗体 ,而接种Pili基因工程疫苗的绵羊于 2 8天产生相应的抗体 ;被免疫绵羊血清中的抗体可维持 6个月以上。用Pili_oviIL2融合基因工程疫苗接种兔和绵羊的免疫试验表明 ,Pili_oviIL2融合基因工程疫苗具有较好的体液免疫应答反应 。

抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的建立

以我国分离的水貂肠炎细小病毒（ＭＥＶ）为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠获得的脾细胞与ＮＳ－１骨髓瘤细胞融合，筛选出８株分泌抗ＭＥＶ的单克隆抗体杂交瘤细胞。经鉴定，８株杂交瘤细胞都属于Ｂ型抗ＭＥＶ单克隆抗体。

鹿坏死杆菌病的综合防治

主要通过疫苗免疫预防、临床治疗和日常预防与管理等方面 。

腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因表达载体的构建及表达

根据腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因 (Pili基因 )序列 ,在 Pili基因 6 19bp Ehe 酶切位点上插入绵羊白细胞介素 - 2基因 (Ovi IL- 2基因 ) ,构建了 Pili基因与 Ovi IL- 2基因的融合基因表达载体。先用 Eco R 、Bam H 双酶切p Bluescript- Ovi IL - 2重组质粒 ,获得两端具有 Eco R 、Bam H 位点的 Ovi IL - 2基因片段 ,用 Klenow补平后 ,与经Ehe 酶切后的重组质粒 PME2 90 - Pili进行平端连接 ;转化 JM10 5感受态细胞 ,筛选阳性克隆 ,分别用 Bam H 、Eco R 、Xba 、Bgl 、Pvu 等进行酶切鉴定。然后将阳性重组质粒转染 BL - 2 1表达宿主感受态细胞 ,用 0 .1m ol/ L Mg Cl2沉淀法和超声波裂解法提取 BL- 2 1表达 Pili基因与 Ovi IL- 2基因融合基因表达蛋白。对流免疫电泳对重组融合蛋白的特异性分析证明 ,融合蛋白主要在宿主菌体中表达 ;SDS- PAGE电泳结果表明 ,重组融合蛋白分子大小约为 330 0 0 ,表达产物的量约占菌体的 5 .49%。

海洋鱼类和青蟹抗菌肽hepcidin和scygonadin的研究

抗菌肽或抗微生物肽因具有杀死或抑制微生物的共同特性,近年来科学家又将这些肽类称为"天然抗生素",有望在将来作为一种新型的生物药物替代现有的化学类抗生素.海洋动物中蕴藏着世界上丰富的抗菌活性物质,研究与开发应用海洋动物抗菌肽成为近年来的研究热点.结合国内外的相关研究进展,简要总结了课题组近年来在我国海水养殖鱼类抗菌肽hepcidin和青蟹抗菌肽scygonadin的研究进展,从抗菌肽的蛋白分离、纯化、基因克隆、基因表达模式、基因工程表达以及抗菌肽合成与表达产品的抗菌活性等进行了简要细致的叙述,对深入探索海洋动物抗菌肽在我国水产养殖业的开发应用具有重要的参考价值.

鹿坏死梭杆菌分离菌株保存试验

厌氧血液琼脂培养基培养的鹿坏死梭杆菌培养物加入脱纤维羊血或兔血，于－20℃下保存可存活3～4个月；于－70℃下保存，可存活2年以上。同样条件下，用含酵母的Eugonbroth培养基直接保存其鹿坏死梭杆菌培养物，也可存活2年；因此，－70℃下保存鹿坏死梭杆菌菌株是实验室最方便的长期保存方法。并测得Eugonbroth保存的菌株于－20℃下保存可存活2～3个月；在厌氧罐中于4℃下可存活15～30天；室温条件下存活7天。冻干保存菌种可在3年以上。

鹿坏死杆菌病病原分离培养的适宜厌氧条件

在我国，迄今未见有关鹿坏死杆菌病的研究报道。本文在试验基础上对鹿坏死杆菌病病料运送及其病原分离培养的厌氧条件进行了选择，为鹿坏死杆菌病的深入研究建立了实验室基础。

拟穴青蟹新型抗菌肽的发现、研究与应用进展

水产养殖业长期过量使用抗生素导致的细菌耐药性增加、水产品中抗生素残留和养殖环境中抗生素污染等问题,已严重影响我国水产养殖业健康发展,因而亟需寻找抗生素的有效替代品.抗菌肽是一类生物体中普遍存在并具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,因其不同于传统抗生素,具有不易产生耐药性等特性,被科学家誉为“天然抗生素”.海洋无脊椎动物是开发高效且抗多种病原微生物的新型抗菌肽的重要来源.本课题组自2002年起一直聚焦我国水产养殖业抗生素污染的重大科学问题,以研发抗生素的有效替代品为目标,致力于海洋动物新型抗菌肽的研发与利用研究,本综述将重点介绍拟穴青蟹(Scylla paramamosain)新型抗菌肽的发现及其应用进展.

雉鸡结核病菌苗免疫的研究

用患结核病雉鸡分离的３种不同血清型的禽结核分枝杆菌制备灭活苗。经现场试验，证明免疫效果良好．雉鸡血清中抗体可维持８～９个月，抗自然感染保护率为８６、７％。人工感染试验保护率为６６．７％。

同向双螺杆挤出机反螺纹元件的特征

一、概述同向旋转双螺杆挤出机在我国塑料加工业中应用已日趋广泛,我国少数厂家亦开始生产这种双螺杆挤出机。为了能够设计出性能优异的双螺杆挤出机,必须了解各种螺杆元件及其组合特性。

弹性硬蛋白溶解试验鉴别反刍动物腐蹄病节瘤拟杆菌强毒株

根据腐蹄病节瘤拟杆菌毒力菌株具有溶解弹性硬蛋白的特性，利用弹性硬蛋白培养基建立了弹性硬蛋白溶解试验，以鉴别节瘤拟杆菌强毒株。试验表明，将不同毒力的菌株同时接种于弹性硬蛋白培养基，蛋白溶解带出现的时间和宽度都显著不同，强毒株大多在７ｄ内，少部分在７～１１ｄ内均出现一条明显的蛋白溶解带；而弱毒株在２１ｄ内基本上未见蛋白溶解带出现。

应用PPA-ELISA检测雉鸡血清中抗结核抗体的研究

用建立的检测雉鸡血清中抗结核抗体的 PPA-ELISA法与平板凝集法同时检测216份雉鸡血清,阳性率分别为54.2%(117份)和43.1%(93份).证明 PPA-ELISA法对于雉鸡结核病诊断具有较高的敏感性和特异性.