抑制素A对牦牛颗粒细胞FSH、LH及其受体表达的影响

为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外源性INHA(0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL^(-1))作用12 h后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测颗粒细胞中FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表达情况,采用酶联免疫分析试验(ELISA)检测细胞内外FSH、LH的含量。结果显示,FSHR和LHR在颗粒细胞质与细胞核中均有表达。FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达随INHA浓度的增大呈先降后升的趋势;INHA浓度接近5 ng·mL^(-1)时,FSHβ表达最低;INHA浓度接近10 ng·mL^(-1)时,LHβ表达最低;FSHR和LHR基因的表达与INHA浓度呈负相关。INHA浓度接近5 ng·mL^(-1)时,颗粒细胞内外FSH含量最低;INHA浓度接近10 ng·mL^(-1)时,颗粒细胞内外LH含量最低;其他INHA浓度下,当颗粒细胞内容物中FSH和LH含量降低时,细胞上清中含量升高。综上所述,INHA对FSHR和LHR基因在颗粒细胞中的表达存在明显的抑制作用,并且影响FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达。研究表明INHA可以抑制牦牛卵泡颗粒细胞中FSH、LH与其受体的结合;同时,INHA对颗粒细胞内外FSH和LH的含量具有重要调节作用。本研究为进一步探索抑制素对雌性牦牛生殖调控的影响提供了理论依据。

INHβB、FSHR和LHR在牦牛不同生殖生理阶段卵巢组织中的表达及差异性分析

为了从受体角度研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)对牦牛不同生殖生理阶段卵巢发挥的功能,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白印迹技术(Western blot)和免疫组织化学技术(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在牦牛发情期、间情期和妊娠期卵巢组织中的表达和定位。结果显示,INHβB在妊娠期牦牛卵巢组织中的表达量显著高于发情期和间情期(P<0.05),而FSHR在发情期的表达量显著高于间情期和妊娠期(P<0.05),LHR则在间情期的表达量显著高于发情期和妊娠期(P<0.05);这3个受体主要分布在卵泡颗粒细胞、卵丘细胞、黄体细胞和卵泡膜上。结果表明,INHβB、FSHR和LHR在牦牛发情期、间情期、妊娠期卵巢组织中均有表达,但其表达量存在一定差异,提示INH、FSH和LH在牦牛不同阶段对卵泡生长发育、卵泡成熟、排卵及黄体的形成发挥着不同的作用,该结果为进一步研究牦牛生殖活动中INH与FSH、LH的互作机制提供参考。

牦牛睾丸发育过程中INHβB、FSHR和LHR的表达差异性分析

为进一步研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)在牦牛精子形成过程中发挥的作用,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹技术(WB)和免疫组织化学法(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在不同年龄牦牛睾丸中的表达及定位。结果显示,INHβB、FSHR和LHR在不同年龄牦牛睾丸组织中均有表达,其相对表达量随年龄增长呈现先上升后下降的趋势;5岁时表达量最高,并显著高于其他3个年龄段(P<0.05)。INHβB、FSHR和LHR蛋白主要分布在睾丸组织的各级生精细胞、支持细胞及间质细胞中。结果表明,牦牛睾丸发育过程中INHβB、FSHR和LHR均可介导相应激素调控精子的生成与成熟,为进一步探索牦牛睾丸的发育及精子的生成提供了研究基础。

Enpp2基因的分子特征及其在雌性牦牛不同繁殖阶段生殖器官中的表达

为了探讨胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(Enpp2)基因在母牦牛不同繁殖阶段生殖器官中的表达与定位,对Enpp2基因进行克隆,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学法检测ENPP2在母牦牛生殖器官中的表达与定位。结果显示,Enpp2基因ORF全长2669 bp,共编码875个氨基酸,表现为高度保守且种属间存在差异性;ENPP2蛋白是一种不稳定的可溶性蛋白,有信号肽。ENPP2在雌性牦牛生殖器官均有表达,其中在卵巢上,妊娠期的相对表达量显著高于卵泡期和黄体期(P<0.05);在输卵管上,黄体期最高,妊娠期最低(P<0.05);在子宫上,妊娠期显著低于卵泡期和黄体期(P<0.05)。免疫组化结果显示,ENPP2主要定位在黄体细胞、卵泡膜和卵泡颗粒层、输卵管黏膜上皮以及子宫内膜和子宫腺上。研究结果可为探究牦牛生殖生理提供理论基础。

整合素β3在牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位中的表达研究

整合素β3作为整合素超家族的一员,在早期胚胎发育和胚胎附植中发挥着重要作用。为探究牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位中整合素β3的表达情况,本研究采集繁殖周期不同阶段(卵泡期、黄体期和妊娠期)雌性牦牛的输卵管组织,按照输卵管不同部位(峡部、壶腹部和漏斗部)将试验材料分为九组,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测整合素β3基因和蛋白在繁殖周期各阶段输卵管不同部位中的表达水平,运用免疫组织化学法对整合素β3进行定位。结果显示,在繁殖周期各阶段中,输卵管峡部的整合素β3表达量均显著高于壶腹部和漏斗部。在峡部中,整合素β3的表达量在妊娠期最高,黄体期最低;而在壶腹部和漏斗部中,整合素β3的表达量在卵泡期最高。免疫组织化学结果显示,整合素β3主要分布于牦牛输卵管的肌层、浆液腺、基细胞、黏膜上皮的分泌细胞、纤毛细胞中。综上所述,整合素β3在牦牛繁殖周期各阶段输卵管的不同部位均有表达,且存在表达差异,由此推测整合素β3对牦牛受精以及早期胚胎的发育发挥着重要作用。本研究结果为进一步探索整合素β3对牦牛生殖繁育的作用提供了理论依据。

牦牛ATG5多克隆抗体的制备及应用

为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中发挥的作用,本研究通过合成牦牛自噬相关5(autophagy related 5,ATG5)基因,并将合成的基因插入pET-32a质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达ATG5重组蛋白并纯化,免疫日本大耳白兔,制备牦牛ATG5多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体的效价,蛋白质印迹(Western blot,WB)技术检测多克隆抗体的特异性。通过Western blot、免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)应用所制备的抗体检测ATG5蛋白在牦牛生殖器官中的表达。结果成功构建了pET-32a-ATG5原核表达质粒,转化大肠杆菌IPTG诱导获得了大小约为53 kDa(含His和Trx标签)的重组蛋白;制备的牦牛ATG5多克隆抗体效价为1∶1280000,特异性良好。应用显示,ATG5蛋白在牦牛睾丸和输卵管中均有表达。本研究成功制备了牦牛ATG5多克隆抗体,特异性良好,可用于检测牦牛ATG5蛋白的表达,为进一步研究自噬在牦牛生殖生理活动中发挥的作用积累了材料。