MultiSite Gateway技术在疟原虫条件性基因打靶载体快速构建中的应用

目的构建可条件性敲除约氏疟原虫ebl基因的打靶载体。方法以约氏疟原虫基因组DNA为模板,PCR扩增EBL-3U和EBL-5U1、EBL-5U2+EBL.orf同源臂片段,利用MultiSite Gateway技术,完成若干DNA片段的定性重组,构建打靶载体pCHD-EBL-RFT,并对质粒酶切和测序鉴定。PCR扩增约氏疟原虫UIS4-5U片段,置换质粒PbUIS4/flp中原有同源臂,并通过位点特异突变技术,获取AvrII和NheI两种线性化位点,构建插入载体PyUIS4/flp。结果构建出打靶载体pCHD-EBL-FRT和PyUIS4/flp,酶切鉴定和测序分析正确。结论将MultiSite Gateway技术成功地用于疟原虫条件打靶载体的构建,建立了以MultiSite Gateway技术为基础的打靶载体构建体系。

卡介苗接种对小鼠伯氏疟原虫感染早期树突状细胞活化状态的影响

为观察疟原虫感染早期卡介苗（BCG）接种对小鼠树突状细胞（DC）活化状态的影响,用Plasmodium berghei ANKA感染C57BL/6小鼠,3天后接种BCG（P.b-3-B实验组）,同时以未接种BCG的感染小鼠为对照.通过动态观察两组感染鼠的原虫血症水平和生存率,流式细胞术检测感染后0、5和8天脾细胞中CD11c＋CD11b＋DC、CD11c＋B220＋DC、CD11c＋CD80＋DC和CD11c＋MHCⅡ＋ DC百分率.结果显示,P.b-3-B实验组的原虫血症从感染后第8天开始逐渐增高,66.7%的小鼠存活至第20天死亡,而对照组小鼠多于感染后8～10天死于脑型疟疾;感染后第5和8天,P.b-3-B实验组小鼠CD11c＋CD11b＋DC、CD11c＋CD80＋DC和CD11c＋MHCⅡ＋DC百分率均显著低于对照组（P〈0.05或P〈0.01）,感染后第8天,CD11c＋B220＋DC百分率也明显低于对照组（P〈0.01）.这些结果表明,疟原虫感染早期接种BCG可下调DC亚群百分率和表面分子表达水平,并以此影响疟疾的感染进程.

混合血清校准品的制备及其在肝、肾功能检验结果互认中的意义

目的探讨利用混合血清制备校准品的可能性,观察实验室间检测结果校准的效果。方法分别检测单份血清和由这些单份血清制备的混合血清的生化指标,检测项目包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)、总胆红素(TBil)、尿素(Urea)和肌酐(Cr)。比较单份血清各项目检测值的均数与混合血清检测值的接近程度。将100份正常人血清(40岁以下成人,男女各半)等量混合为自制校准血清与1例患者血清同时送11家临床实验室检测,检测项目同前。依照同一实验室检测的自制校准血清检测值和《全国临床检验操作规程》(第3版)给定的各项目的参考值对患者血清检测值进行校准,观察校准效果。结果混合血清各项目检测值与单份血清测定值的均数十分接近。患者血清送11家临床实验室检测,ALT、AST、ALP、GGT、Alb、TP、TBil、Urea、Cr检测结果的变异系数(CV)分别为11.65%、3.76%、12.86%、4.71%、3.00%、2.75%、15.35%、5.92%、10.33%,校准后分别为7.47%、5.84%、8.87%、5.00%、2.40%、1.87%、4.71%、3.02%、4.94%。结论肝、肾功能评价常用指标,混合血清具有较好的单份血清可加平均性;依照自制校准血清检测值和约定真值对待检血清检测值进行校准效果明显。

左旋精氨酸上调约氏疟原虫感染DBA/2小鼠的抗体应答效应

探讨左旋精氨酸(L-Arginine,L-Arg)对约氏疟原虫(Plasmodium yoelii17XL,P.y17XL)感染DBA/2小鼠体液免疫应答的调节效应。于P.y17XL感染前7 d,连续每日给予DBA/2小鼠L-Arg(1.5 g/kg体重)灌胃预处理,动态观察各组感染小鼠原虫血症水平和生存率;于感染后第0、8和10天分别提取小鼠脾细胞,流式细胞术检测DBA/2小鼠浆细胞分泌IgG1和IgG2a的水平。与NC组比较,L-Arg能够显著降低感染小鼠的原虫血症水平,自愈时间提前。感染后8 d和10 d,L-Arg组CD138+B220+IgG1+细胞数量出现有意义的增加,感染后10 d,L-Arg组CD138+B220+IgG2a+细胞数量明显升高。L-Arg处理可诱导DBA/2小鼠建立更加有效的抗体免疫应答,明显加速DBA/2感染小鼠清除疟原虫。

左旋精氨酸通过上调Th1应答介导抗疟保护性免疫

目的探讨左旋精氨酸(L-Arginine,L-Arg)对致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)感染BALB/c小鼠Th1免疫应答的调节效应。方法于P.y17XL感染前7天,连续每日给予BALB/c小鼠L-Arg(1.5 g.kg-1体质量)灌胃预处理;动态观察各组感染小鼠原虫血症水平和生存率;于感染后d 0、d 3和d 5分别提取小鼠脾细胞,流式细胞术检测BALB/c小鼠CD4+CD69+T细胞、F4/80+CD36+巨噬细胞数量;ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平,Griess反应检测脾细胞培养上清中NO含量。结果与NC组比较,L-Arg能够降低感染小鼠的原虫血症水平,延长生存时间。L-Arg组CD4+CD69+T细胞数量出现有意义的增加,IFN-γ分泌水平明显提高,F4/80+CD36+巨噬细胞数量出现明显升高,NO的分泌也明显增加。结论在感染早期L-Arg处理可诱导Th1免疫应答的有效建立,明显遏制P.y17XL感染早期红内期疟原虫的感染进程。

脂多糖对约氏疟原虫感染DBA/2小鼠感染早期的免疫调节作用

目的本文主要探讨脂多糖(LPS)在致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17×L,Pyl7×L)感染早期的调节作用。方法 6～8w、雌性DBA/2小鼠,随机分为实验组和对照组,经腹腔接种1×106 Pyl7XL寄生的红细胞。实验组于感染后d2静脉给予LPS(25μg/只)。动态观察两组小鼠的原虫血症水平,小鼠脾脏树突亚群及其表面TLR4和活化T细胞的表达水平。结果 (1)两组小鼠于感染后约d15均自愈,LPS处理组小鼠的原虫血症水平在感染后d5-8显著低于对照组;(2)与对照组相比,在感染后d3和d5,LPS处理组小鼠脾脏DCs亚群表达水平显著升高,在感染后d3,TLR4表达水平显著升高。在感染后d5,LPS处理组小鼠脾脏细胞培养初始活化T表达水平显著升高。结论在P.y17×L感染早期,LPS可通过激活TLR4强化DC成熟进一步强化Th1免疫应答反应,降低原虫血症,这将为疫苗的开发提供新的靶点。

HLA-DQB1多态性与肿瘤化疗前后肝肾功能变化的关联

化疗是目前肿瘤治疗中最常用的手段之一。同时，化疗药物的副损伤也较大，其在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，因而会对组织器官造成损害，使部分患者因恶心、呕吐、腹泻、乏力、食欲不振、白细胞减少和血小板下降等不良反应而无法坚持完成治疗。作者注意到：肿瘤化疗药物在肿瘤患者体内的药代动力学和药物效应、毒性方面均存在显著的个体差异。

HLA-DRB1、DQB1多态性与肿瘤化疗前后电解质代谢变化的关联

目的通过不同肿瘤患者在化疗前和化疗结束时的电解质代谢变化以及其与HLA-DRB1、DQB1多态性的关联,以期找到肿瘤化疗副损伤的相关的基因。方法选取24例恶性肿瘤病人,采用多聚酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)法检测其HLA-DRB1/DQB1的多态性。同时检测肿瘤患者化疗前和化疗结束时的电解质指标,包括:K+、Na+、C-l、Mg2+、P3+和Ca2+。结果Ca2+的降低与HLA-DQB1*02有相关性;Na+的升高与HLA-DRB1*08有相关性;C-l的降低与HLA-DQB1*05有相关性,升高与HLA-DRB1*07有相关性。结论HLA可能是肿瘤化疗副损伤的标志性基因。

高考应激实验指标变化与DQB1基因多态性关系

目的探讨高考应激对机体的血清生化、免疫指标的影响及其与人类白细胞抗原-DQB1(HLA-DQB1)等位基因的关系。方法随机选取沈阳某重点中学27名学生,高考前1个月作为实验组和某学校开学2个月后的学生作为对照组。测定白蛋白、总蛋白、总胆红素、直接胆红素、尿素、肌酐、尿酸、葡萄糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、转肽酶、钙、钠、钾、氯、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、IgG、IgA、IgM、C3、C4。采用全自动生化分析仪完成检测;HLA-DQB1采用PCR法检测。结果高考应激组白蛋白(50.1±1.6)g/L,葡萄糖(4.8±0.3)mmol/L,碱性磷酸酶(94.6±26.0)U/L,钙(2.4±0.1)mmol/L,钾(4.2±0.3)mmol/L,补体C3(1122.5±169.2)mg/L,与对照组比较,均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);直接胆红素(3.3±1.4)μmol/L,谷草转氨酶(16.3±3.7)IU/L,总胆固醇(3.6±0.5)mmol/L,与对照组比较明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);HLA-DQB1各等位基因阳性携带和阴性携带者各检测指标水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论某些临床常规血清生化、免疫指标可以作为观察社会心理性应激程度的敏感指标。

卡介苗对啮齿类脑型疟疾保护作用

目的探讨卡介苗(BCG)对啮齿类脑型疟疾(CM)的免疫保护效应。方法以伯氏疟原虫感染C57BL/6小鼠,3 d后接种BCG冻干粉(实验组),同时以未接种BCG的感染鼠为对照组,动态观察2组小鼠原虫血症水平和生存率;流式细胞术检测感染后第0、5、8 d小鼠脾细胞中CD4+CD69+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率;ELISA方法检测脾细胞培养上清中细胞因子水平。结果实验组小鼠原虫血症从第9 d开始逐渐增高,66.7%的小鼠一直存活到感染后第20 d;而对照组小鼠全部于感染后8～10 d死于CM;感染后第5和第8 d,实验组活化性T细胞百分数分别为15.45%和11.47%,IFN-γ水平分别为550.24和407.46 pg/mL,均明显低于对照组的17.74%和15.42%、709.48和600.37 pg/mL(均P<0.05);而调节性T细胞百分率分别为10.03%和15.18%,IL-10水平分别为930.48和265.87 pg/mL,均明显高于对照组的7.09%和11.77%、603.3和116.27 pg/mL(均P<0.05)。结论 BCG可通过下调炎性反应强度降低CM发生率并延长宿主存活期。