治疗多重耐药结核病新药的发展史及临床特点

近20年,在世界卫生组织(WHO)的推动下,先后有20余种新药或再利用药物进入临床试验,针对多重耐药结核病,WHO推荐了包含新药贝达喹啉和普托马尼/德拉马尼组成的方案。国内应用正起步,本文就这2类新药的历史背景、作用机制、药物代谢特点和临床应用等内容进行综述讨论,以促进临床医生对新药的正确应用。

结核分枝杆菌特异性抗原反应性因子对活动性肺结核的鉴别诊断意义

目的研究活动性肺结核和细菌性肺炎及原发性支气管肺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后的多因子表达特点及诊断意义。方法 100例初治活动性肺结核患者,35例细菌性肺炎和原发性支气管肺癌患者,分离外周血单个核细胞（PBMCs）,用结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激,采用FlowCytomix流式技术检测细胞培养液上清上中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IP-10（CXCL10）和MIG（CXCL9）的表达,用接受者工作特征曲线（ROC curve）评价以上结核分枝杆菌抗原特异反应性因子的诊断价值。结果 PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后,培养液上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IP-10和MIG水平显著升高,初治活动性肺结核患者与其他肺病对照组差别显著（中位值分别为595.0/0.0 pg/ml,338.0/48.6 pg/ml,226.0/0.0 pg/ml,3 865.0/297.0 pg/ml,3541.0/81.1 pg/ml;P值均〈0.000 1）,ROC曲线下面积（95%CI）分别为0.917 1（0.862 9~0.971 4）,0.807 0（0.724 6~0.889 4）,0.854 9（0.785 5~0.924 2）,0.920 0（0.870 8~0.969 2）,0.936 3（0.894 4~0.978 1）,IFN-γ诊断特异性为94.3%,联合IP-10诊断提高敏感性至92.1%。结论结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激外周血单个核细胞产生的MIG、IP-10和IFN-γ能够良好的鉴别初治活动性肺结核及常见的细菌性肺炎和原发性支气管肺癌,可能成为新的诊断指标。

初治菌阳肺结核患者外周血NK细胞比例显著下降

目的研究活动性肺结核患者外周血淋巴细胞群内NK细胞比例及自发凋亡率特点。方法初治菌阳肺结核患者和体检健康的正常对照各20例,年龄和性别无显著差异,密度梯度离心分离PBMCs,用流式细胞仪分析CD3-CD16+CD56dimNK细胞和CD3-CD56highNK细胞在淋巴细胞群的比例,培养24 h后用Annexin V-PI方法流式细胞术检测自发凋亡率。结果初治菌阳肺结核患者外周血NK细胞比例显著下降,CD3-CD16+CD56dimNK细胞比例下降尤为显著(P<0.000 1),其自发凋亡率显著升高(P<0.000 1)。结论初治菌阳肺结核患者体内具有细胞毒功能的NK细胞比例显著下降,对抗结核分枝杆菌活化的力量被消减。NK细胞自发凋亡率显著升高可能是其比例下降的原因之一,但其机制及与结核免疫的关系尚需进一步研究。

结核性脑膜炎患者脑脊液基质金属蛋白酶-9及其抑制剂检测

目的:探讨结核性脑膜炎患者脑脊液中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)水平的变化意义。方法:选取5例非肿瘤非感染性头痛患者脑脊液作对照,9例病毒性脑膜炎,12例结核性脑膜炎患者。12例结核性脑膜炎根据有无意识障碍或脑实质损害的症状分为两组,A组有意识障碍或脑实质损害症状,7例;B组无意识障碍或脑实质损害症状,5例。酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测脑脊液MMP-9和TIMP-1水平。结果:结核性脑膜炎脑脊液MMP-9的水平及MMP-9/TIMP-1比例显著增高,A组增高得更显著。结论:脑脊液MMP-9水平及MMP-9/TIMP-1比例对结核性脑膜炎的诊断和预后有参考价值。

活动性肺结核病人外周血CD4^+/CD8^+Tim-3^+ T细胞群内记忆细胞分布特点

目的研究活动性肺结核病人外周血CD4+/CD8+Tim-3+T细胞群内记忆细胞分布特点。方法分离22例初治活动性肺结核病人PBMCs,用流式细胞仪分析比较CD4+/CD8+Tim-3+/Tim-3-T细胞群内的中央型记忆细胞(Tcm)和效应型记忆细胞(Tem)的分布。结果活动期初治肺结核病人外周血CD4+Tim-3+T细胞群包含更少的中央型记忆细胞(P<0.0001)和较多的效应型记忆细胞(P=0.0139),CD8+Tim-3+T细胞群包含较少的效应型记忆细胞(P=0.0065)。结论活动期初治肺结核CD4+Tim-3+T细胞群内含有更多的效应型记忆细胞可能会促使Tem对抗原的快速保护性免疫应答效应下降,从而促进结核分枝杆菌潜伏感染向活动性病变转变。Tim-3对记忆性T细胞分化、形成及功能的影响尚需进一步研究。

口服利福平海藻酸钠微球的制备

目的研制口服利福平海藻酸钠微球。方法采用静电液滴法制备利福平海藻酸钠微球,测定粒径大小、包封率、载药量及其影响因素,考察微球的体外释放特点。结果微球球形圆整,分散性好,平均粒径70.2μm,包封率83.5%,载药量17.1%,在模拟肠液中的释放呈快慢相,时间长而药物释放完全。结论以海藻酸钠、硬脂酸为材料,用静电液滴法制备利福平微球,球径小、包封率高、释药时间长,工艺简便。

大鼠口服利福平海藻酸钠微球的体内药动学研究

目的为解决抗结核治疗的药物依从性低的问题,研制具有缓释效果的利福平海藻酸钠微球,比较研究大鼠口服后的体内药动学变化特点。方法采用静电液滴法制备利福平海藻酸钠微球,将利福平粉剂和利福平微球分别喂服两组大鼠后,采用高效液相色谱法测定不同时间点的血药浓度,以3p87处理全血药物浓度数据,计算药物动力学参数。参数用Excel进行统计分析。结果测定方法线性关系良好,日内、日间RSD均<7%,能满足测定要求。口服利福平海藻酸钠微球和普通利福平药粉比较,Cmax较小(P<0.05),Tmax较大(P<0.01),AUC较大(P<0.01),利福平海藻酸钠微球消除慢,并能保持约36h的有效杀菌浓度。结论测定方法准确、精密度高,是一可靠的测定血清利福平浓度的方法;口服利福平海藻酸钠微球具有显著的缓释效果。

ESAT-6，CFP-10诱导的活动期肺结核患者PBMCs细胞因子的特点

目的研究活动期肺结核病人和结核分枝杆菌ElISpot阳性健康体检者(结核分枝杆菌潜伏感染者)外周血单个核细胞(PBMCs)经结核分枝杆菌特异性抗原肽(ESAT-6,CFP-10)刺激后Th1、Th2、Th17和Treg细胞代表性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β的表达特点及意义。方法 24例初治活动期肺结核患者和25位结核分枝杆菌潜伏感染者,分离外周血单个核细胞(PBMCs),用ESAT-6,CFP-10肽库刺激PBMCs,采用FlowCytomix流式技术检测细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β的表达。结果 PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后,IL-17反应低下,而IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β均因刺激而升高,但只有IFN-γ和TNF-α的水平在2组中具有显著性差异(P=0.013,P=0.006)。结论Th1细胞因子可能在结核病免疫病理中发挥更大的作用。

结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)对CD4^+ CD154^+ T细胞的影响

目的通过研究结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)对CD4+ CD154+ T细胞亚群的影响,探讨结核分枝杆菌分泌蛋白的致病性。方法 PPD或/和BCG刺激PBMCs后,用流式细胞术检测活动性肺结核的CD4+ CD154+ T细胞和CD4+IFN-γ+T细胞的比例变化。结果①PPD刺激显著下调CD4+ CD154+ T细胞比例,能够抑制BCG刺激产生的CD4+ CD154+ T细胞的增殖;②PPD刺激CD4+ IFN-γ+ T细胞的效果显著低于BCG。结论 PPD内存在能显著抑制机体保护性免疫的分泌蛋白,可能是结核杆菌进入人体后抑制机体免疫力的重要因素之一。

结核性脑膜炎脑脊液抗干扰素-γ自身抗体的检测

目的:建立检测脑脊液中抗干扰素-γ(IFN-γ)自身抗体的ELISA方法,并检测结核性脑膜炎患者脑脊液中抗IFN-γ自身抗体水平,初步探讨抗IFN-γ自身抗体与结核性脑膜炎发病机制的关系。方法:通过对封闭条件、抗原用量等条件进行优化,建立检测脑脊液中抗IFN-γ自身抗体的ELISA检测方法。采用建立的最佳检测条件对21例结核性脑膜炎患者和6例正常对照者的脑脊液进行抗IFN-γ自身抗体检测。结果:在14例重症结核性脑膜炎患者的脑脊液中测到高滴度的抗IFN-γ自身抗体,平均值和阳性比例明显高于正常对照者和7例轻症患者(P<0.01),轻症患者的阳性比例高于正常对照者(P<0.05)。结论:检测方法简便、可靠,结核性脑膜炎患者脑脊液中存在抗IFN-γ自身抗体,与病情程度相关,对抗IFN-γ自身抗体的研究有助于进一步探讨结核性脑膜炎的免疫病理机制。

淋巴结结核脓液病原学诊断特点

目的分析首次诊断为淋巴结结核病例的脓液病原学诊断特点,为临床医生提供选择诊断方法的理论依据。方法收集我中心结核临床实验室2016年1月—2017年12月所有淋巴结结核脓液标本的病例资料,从中选出首诊时在超声引导下或无超声引导下用注射器穿刺抽脓的初诊淋巴结结核病例51例。分析病例的相关临床资料,包括性别、年龄、病原学检验结果、病理学结果、影像学结果等。结果 51例病例中,女性31例;年龄18~78岁,平均为(33.0±13.7)岁,20~30岁者占54.8%;肺部CT无异常表现的有32例;15例病例行细针穿刺病理学检查,呈典型干酪样坏死改变3例。将同时行脓液结核分枝杆菌核酸检测(nucleic acid amplifi cation tests, NAAT)和抗酸染色涂片的标本检测结果进行比较,NAAT阳性率为88.2%,抗酸染色涂片阳性率为19.6%,2者比较差异有统计学意义(P <0.05);将同时行结核分枝杆菌NAAT和分枝杆菌快速培养的标本检测结果进行比较,NAAT阳性率为91.3%,分枝杆菌快速培养阳性率为30.4%,2者比较差异有统计学意义(P <0.05)。结论对于淋巴结结核的诊断,将抽吸的脓液行NAAT可以作为首选诊断方法。

大鼠淋巴结利福平浓度的测定

目的研究大鼠口服利福平后淋巴结的药物浓度变化特点,为淋巴结结核治疗方法的改进提供理论依据。方法Wistar大鼠15只,随机分为3组,每组5只,禁食12 h后,喂服利福平10 mg.kg-1,分别于给药后2,8,24 h行眼球摘除取血并摘取肠系膜淋巴结,采用高效液相色谱法测定不同时间的腹腔淋巴结药物浓度及血清药物浓度。结果血清利福平与淋巴结利福平浓度呈良好线性关系,日内、日间RSD均<7%,能满足测定要求。各时间点利福平淋巴结浓度达到其抑菌浓度水平,但均显著低于血药浓度(P<0.01)。结论该方法准确度高,是一可靠的测定淋巴结利福平浓度的方法;淋巴结内利福平浓度显著低于血药浓度,淋巴结结核的治疗需要提高淋巴结局部药物浓度。

结核性脑膜炎患者脑脊液基质金属蛋白酶-9的检测意义

在脑膜炎的发展过程中,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)对降解基底膜和损伤血脑屏障发挥重要作用,结核分枝杆菌能够刺激单核-巨噬细胞过度表达MMP-9。为检测结核性脑膜炎患者脑脊液MMP-9水平,评价其对结核性脑膜炎诊断及治疗的意义,应用ELISA方法检测12例结核性脑膜炎和9例病毒性脑膜炎患者脑脊液MMP-9水平,并选取5例非肿瘤非感染性头痛患者脑脊液作对照组。结果显示,结核性脑膜炎脑脊液MMP-9的水平显著增高,中枢神经系统并发症发生率与MMP-9的水平相关。结论为脑脊液MMP-9水平对结核性脑膜炎的诊断和预后有参考价值。

结核病专科非结核分枝杆菌肺病菌种分布及病例特点研究

目的研究309医院结核病研究所接收的肺病病人中非结核分枝杆菌(NTM)肺病的菌种分布及病例特点,为临床诊断提供思路。方法收集309医院结核病研究所临床实验室2014年9月至2018年3月非结核分枝杆菌阳性报告,根据2012年版中华医学会《非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识》建立确诊NTM肺病组,研究NTM肺病组中NTM的分布特点;根据NTM肺病组病例的年龄、性别、地域和发病时限建立配对肺结核组,研究两组病人基础状态的差别。结果 NTM阳性108例,分离率为4.66%。确诊NTM肺病72例,分离率为3.10%,90%病例来自华北和东北地区。包括胞内分枝杆菌(33/72,45.8%),龟/脓肿分枝杆菌(27/72,37.5%),鸟分枝杆菌(7/72,9.7%),堪萨斯分枝杆菌(3/72,4.2%),蟾蜍分枝杆菌(2/72,2.8%)。NTM肺病患者明确诊断用时平均27.8±30.8个月;平均年龄64.1±18.0岁;男女比例1.88∶1;>80岁组全部为男性,11/13为龟/脓肿分枝杆菌肺病;NTM肺病患者的基础性呼吸系统慢性疾病发生率高于肺结核病患者,差异有统计学意义(χ~2=4.141,P=0.042);女性NTM肺病的基础性支气管扩张发生率显著高于男性NTM肺病患者(χ~2=10.277,P=0.006)。龟/脓肿分枝杆菌肺病平均年龄75.2±14.8岁,胞内NTM肺病患者平均年龄59.9±17.0岁,这两种肺病的年龄分布差异有统计学意义(χ~2=14.832,P=0.011)。结论华北东北地区主要的NTM肺病致病菌是胞内分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌;40岁之后NTM肺病发病率随年龄增多;80岁之后以龟/脓肿分枝杆菌为主;女性NTM肺病发病年龄相对小,基础性支气管扩张是女性NTM肺病的易感因素;NTM肺病明确诊断用时长,分枝杆菌核酸检验可以显著提高诊断效率。

肺结核患者CD4^+记忆T细胞亚群的检测分析

目的:研究肺结核患者外周血总CD4+记忆T细胞及抗原特异性记忆T细胞的产生及分布规律,了解记忆T细胞在结核发病中的作用。方法:以荧光标记的抗CD4、CCR7、CD45RA3种抗体共染色,用流式细胞仪检测肺结核患者外周血总CD4+记忆T细胞;以荧光标记的抗人CD4、CD154、CCR7、CD45RA4种抗体共染色,检测结核抗原特异性CD4+记忆T细胞。通过对比分析,了解记忆T细胞分布特征。结果:肺结核患者外周血总CD4+T细胞中CD45RA+CCR7+T细胞、CD45RA-CCR7+T细胞和CD45RA-CCR7-T细胞这三群的比例分别为(59.18±16.11)%、(15.40±6.48)%和(16.30±9.97)%;而在抗原特异性CD4+T细胞中三群T细胞的比例分别为(32.67±13.94)%、(56.96±12.70)%和(8.76±5.62)%。通过统计学比较后发现,总CD4+T细胞和抗原特异性CD4+T细胞这两组之间CD45RA+CCR7+T细胞、CD45RA-CCR7+T细胞和CD45RA-CCR7-T细胞的分布比例差异均有显著性。结论:肺结核患者外周血总CD4+T细胞中以初始细胞为主,而抗原特异性CD4+T细胞中则以中央记忆细胞为主,说明结核病患者可以产生抗原特异性记忆T细胞,参与长效免疫,可能在防止再感染或者降低再感染的严重程度方面起重要作用。

活动性结核病人PBMCs中转录因子PLZF的表达降低与iNKT细胞的减少相关

目的:比较活动性结核病人和健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中转录因子PLZF(Promyelocytic leukemiazinc finger)的表达和iNKT细胞含量的差异,研究活动性结核病人PBMCs中PLZF的表达与iNKT细胞含量的相关性。方法:采集活动性结核病人和健康人新鲜的抗凝血,淋巴细胞分离液分离PBMCs。每个样本的PBMCs分两份,一份细胞用Trizol法提取总RNA,荧光定量PCR检测PLZF mRNA的相对表达量;另一份细胞用特异性抗体标记iNKT细胞,流式细胞仪检测iNKT细胞的含量。统计学软件分析两组样本PLZF的表达和iNKT细胞含量的差异,以及PLZF的表达与iNKT细胞含量的相关性。结果:活动性结核病人PMBCs中PLZF的表达和iNKT细胞含量均显著低于健康对照(P值分别为0.010 2和0.001 2),PLZF的表达与iNKT细胞的含量成正相关(r=0.480 4,P=0.027 5)。结论:活动性结核病人PLZF的表达降低与iNKT细胞百分含量的减少相关。

结核病患者外周血中iNKT细胞的数量显著降低

目的:比较结核病患者和健康对照外周血iNKT细胞数量的差异,分析结核病患者伴发糖尿病对外周血iNKT细胞数量的影响。方法:采集37例结核病患者和12例健康志愿者的静脉血,用特异性抗体anti-Vα24-PE/anti-Vβ11-FITC标记iNKT细胞,流式细胞术(FCM)检测外周血中iNKT细胞的含量。结果:结核病患者和健康对照外周血iNKT细胞的百分含量分别为0.01%(0.24%/0.00%)和0.08%(0.19%/0.00%),差异显著(P<0.01)。伴发糖尿病的结核病患者和非糖尿病的结核病患者iNKT细胞的百分含量分别为0.015%(0.09%/0.00%)和0.01%(0.24%/0.00%),差异无统计学意义(P>0.05)。结论:结核病患者外周血中iNKT细胞数量明显减少,伴发糖尿病对结核病患者外周血iNKT细胞数量没有显著影响。

结核抗原特异性CD4^＋中央型记忆T细胞的检测及分布特性研究

目的比较活动期肺结核患者和纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)试验阳性健康人记忆T细胞的产生和分布特性。方法取乙二胺四乙酸(ethylene diaminete traacetic acid,EDTA)抗凝静脉血,Ficoll进行密度梯度离心获取PBMCs。采用卡介苗刺激后,通过CD4、CD154、CCR7、CD45RA4种抗体共染色,用流式细胞仪检测结核抗原特异性CD4+记忆T细胞。结果以CD4+CD154+双阳性区设门,研究结核抗原特异性CD4+记忆T细胞,结果显示,肺结核患者CD4+CD154+CD45RA-CCR7+中央型T淋巴细胞亚群分布频率显著降低(P<0.05),CD4+CD154+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群的比例明显增高(P<0.05)。结论肺结核患者CD4+中央型记忆T淋巴细胞亚群的产生存在异常,可能与免疫功能低下和结核病发病密切相关。

异烟肼、利福平治疗肺结核致肝毒性易感基因的研究

目的 :探讨N 乙酰基转移酶 (NAT2 )基因型与异烟肼、利福平治疗肺结核致肝毒性的相关性。方法 :通过聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术分析 6 7例经利福平、异烟肼治疗后发生或未发生肝功能异常的肺结核患者NAT2基因多态性的部位、性质及发生率。结果 :病例组和对照组 85 7位密码子多态性分别是 2 0 .3%和 7.1% ,两组差异显著。结论 :NAT2基因型与异烟肼和利福平所致肝毒性关系密切 ,其中 85 7位密码子点突变可能是结核患者发生肝毒性的易感基因型之一。