目的:构建包含外源性miR-134前体的真核表达载体,并使其在人类少突胶质瘤(oligodendroglia,OL)细胞中表达,为进一步研究miR-134的功能及作用靶标提供技术支持。方法:从人类OL细胞基因组DNA扩增miR-134前体,将所得目的片段克隆到pEGFP-N...目的:构建包含外源性miR-134前体的真核表达载体,并使其在人类少突胶质瘤(oligodendroglia,OL)细胞中表达,为进一步研究miR-134的功能及作用靶标提供技术支持。方法:从人类OL细胞基因组DNA扩增miR-134前体,将所得目的片段克隆到pEGFP-N1载体上,重组质粒经测序鉴定后将其转染至人类OL细胞中,荧光倒置显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达情况,并采用荧光定量PCR检测miR-134基因水平的表达。结果:pEGFPmiR-134重组质粒经酶切、PCR鉴定可见目的条带与预期结果一致,经测序可见插入序列正确。将重组质粒转染OL细胞后,荧光定量PCR结果示pEGFP-N1空质粒转染组与空白对照组的miR-134表达水平无统计学差异(P=0.882);pEGFP-miR-134质粒转染组miR-134表达水平是pEGFP-N1空质粒转染组的52倍,两者具有统计学差异(P=0.023)。结论:通过构建真核细胞表达质粒可以高效表达外源性microRNA分子,为后续的研究奠定实验基础。展开更多
文摘目的:构建包含外源性miR-134前体的真核表达载体,并使其在人类少突胶质瘤(oligodendroglia,OL)细胞中表达,为进一步研究miR-134的功能及作用靶标提供技术支持。方法:从人类OL细胞基因组DNA扩增miR-134前体,将所得目的片段克隆到pEGFP-N1载体上,重组质粒经测序鉴定后将其转染至人类OL细胞中,荧光倒置显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达情况,并采用荧光定量PCR检测miR-134基因水平的表达。结果:pEGFPmiR-134重组质粒经酶切、PCR鉴定可见目的条带与预期结果一致,经测序可见插入序列正确。将重组质粒转染OL细胞后,荧光定量PCR结果示pEGFP-N1空质粒转染组与空白对照组的miR-134表达水平无统计学差异(P=0.882);pEGFP-miR-134质粒转染组miR-134表达水平是pEGFP-N1空质粒转染组的52倍,两者具有统计学差异(P=0.023)。结论:通过构建真核细胞表达质粒可以高效表达外源性microRNA分子,为后续的研究奠定实验基础。