猪流感病毒的流行现状及疫苗研究进展

猪流感(swine influenza,SI)是猪的重要呼吸道疾病之一,其特征为发热、咳嗽、呼吸困难、食欲不振等。临床上SI感染病死率较低,但常导致饲料利用率下降,生长性能差,可与其他病原体合并感染而引起高发病率甚至死亡。猪在流感种间传播中起着复杂且重要的作用,SI的发生不仅给养猪业造成巨大经济损失,对公共卫生也造成严重威胁。论文对近10年我国猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)感染的流行病学、病毒进化、跨物种传播、疫苗研发等情况进行综述,分析了综合防控策略,为SI的风险评估和综合防控提供参考。

市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的分离鉴定及毒力岛基因检测

目的:监测市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的污染情况,检测分离菌株的致病性及其毒力岛基因携带情况,了解沙门氏菌分离株毒力岛基因的携带与其致病力的相关性。方法:从陕西省不同地市的超市中随机购买鲜鸡蛋,无菌取其蛋壳膜分离沙门氏菌,聚合酶链式反应方法扩增沙门氏菌菌属特异性invA基因鉴定分离株;对分离菌株进行无特定病原体(SPF)雏鸡的致病性试验,依据GenBank发表的基因序列,设计引物聚合酶链式反应检测沙门氏菌毒力岛(SPI)核心蛋白基因。结果:从陕西省55家超市1100枚鲜蛋中分离鉴定出30株沙门氏菌,分离率达2.73%;动物致病性实验表明,30株沙门氏菌中13株有致病力,其中强致病力菌株有7株,占23.3%;分离菌株的毒力岛基因携带率分别为:SPI-1 60%、SPI-2 73.3%、SPI-3 100%、SPI-4 90%、SPI-5 76.7%,毒力岛基因SPI-1+SPI-2的携带与细菌致病性有关。结论:市售鲜鸡蛋中沙门氏菌携带率为2.73%,分离菌株对动物具有一定的致病力,毒力岛基因SPI-1+SPI-2的携带与沙门氏菌的致病性呈正相关。

林麝出血性肺炎病原菌的分离鉴定和菌影疫苗的制备

为了科学有效防控林麝出血性肺炎,本试验对发生出血性肺炎的死亡林麝进行病理剖检,采取病变肺脏进行细菌分离纯化、生化和16S rRNA测序鉴定及耐药性检测,并制备菌影疫苗开展小鼠免疫保护试验。结果显示,从表现典型出血性肺炎病变的林麝肺脏样本中分离鉴定出3株大肠杆菌,分离株对小鼠均有致病性,药敏试验均为多重耐药菌株;采用0.4 mg/mL氢氧化钠溶液裂解大肠杆菌分离株制备菌影疫苗,以0.5×10^(8)CFU/只剂量2次免疫小鼠后能提供100%的免疫保护。结果表明,从患出血性肺炎的林麝肺脏中分离到致病性大肠杆菌,制备的菌影疫苗对小鼠具有良好的免疫保护效果,为林麝大肠杆菌性出血性肺炎的防控提供了新思路。

煤矿充填固碳理论基础与技术构想

在国家“双碳”目标背景下,如何减少煤炭行业的碳排放、实现碳封存已成为亟待解决的难题。煤炭行业作为高碳化石能源生产者和主体碳排放源提供者,在生产和消费过程中引发的大宗固废堆存、大型采空区形成和大量CO_(2)排放是制约煤炭可持续开发利用与绿色健康发展的瓶颈所在。为协同解决二氧化碳封存与矿山固废消纳问题,将大宗固废处置、固废高值化利用、CO_(2)封存、采空区利用有机结合,提出了二氧化碳充填的理念,从碳汇能力评估角度界定了二氧化碳充填的3种类型。具体开展工作包括:①分析了CO_(2)充填料浆输运过程和矿化反应过程涉及到的基础理论,给出了各个过程的数学方程以及碳封存量计算公式,指出了温度、湿度等因素对矿化反应机理、碳封存量和充填体强度的影响规律。②总结了现阶段CO_(2)矿化的工艺方法、主要碱性工业固废的CO_(2)封存能力和CO_(2)矿化强化措施。在此基础上提出了基于直接湿法矿化和间接矿化的2种CO_(2)充填材料制备工艺,满足矿井充填的流动性、凝固特性和强度要求。③针对CO_(2)充填过程中的CO_(2)物理封存问题,提出了窄条带式胶结充填和综采架后胶结充填2种技术路径,前者通过在弱充填条带中构筑多贯通孔隙的充填体CO_(2)物理封存,后者借助充填支架和链式自行充填挡板在长壁工作面采空区中间断构筑充填带,控制顶板垮落,形成CO_(2)物理化学封存空间。④为了评估CO_(2)充填的碳平衡效果,依据全生命周期法界定了CO_(2)充填中碳足迹及碳消纳的计算边界。然后,梳理了CO_(2)充填过程中的碳足迹及碳消纳,分别考虑了CO_(2)的来源、用量、损耗、转化等因素。给出了包括原料运输、充填料浆制备、井下注入与充填等过程中的碳足迹及碳消纳计算方法。研究成果有望降低CO_(2)封存的能耗及成本,对煤炭绿色开采及其可持续开发利用具有深远的意义。

布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。

猪细小病毒和猪圆环病毒2型二重液相芯片检测方法的建立

作者拟建立检测猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二重液相芯片(xMAP)检测方法,以满足出入境检疫和临床高通量检测的要求。依据GenBank中PPV结构蛋白VP2基因及PCV2全基因序列,设计PPV和PCV2特异性探针、引物及探针互补序列,将探针与磁性微球偶联,对下游引物和探针互补序列标记生物素,采用不对称性二重PCR扩增靶序列,将PCR产物与偶联好的探针进行杂交,用液相芯片仪进行检测。通过对检测条件优化,建立检测PPV、PCV2两种病毒的二重液相芯片技术,并对临床样本进行检测。建立的PPV和PCV2二重液相芯片检测方法,特异性良好,该方法对PPV和PCV2基因拷贝数检测下限分别为1.53×104、2.58×102;对56份临床样品检测表明,该方法与单项PCR检测结果符合率为100%。成功建立了PPV、PCV2二重xMAP检测方法,该检测技术可用于出入境检疫和兽医临床检验。

鸡肾型IBV地方分离株N基因的克隆及分子遗传变异分析

用RT-PCR方法对分离于陕西省不同地区的8个鸡肾型IBV毒株的Ⅳ基因分别进行了扩增,将各扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞筛选阳性克隆质粒并进行基因测序,用DNAstar软件将这8个毒株与GenBank收录的7个IBV代表毒株的Ⅳ基因进行了比较分析,研究了其变异情况。结果表明,B01,YL,WH和 YX株与7株代表毒株的同源性较高,而G,BJ,WG,FF株与7个代表毒株的同源性相对较低。氨基酸推导序列比对结果表明,N蛋白突变以散在的点突变形式为主,其中46,48,50,75,78,189,232,236,237,299,301,350,366等位点容易发生突变,突变位点无明显规律性。

陕西省鸡致病性大肠杆菌的分离及血清型鉴定和药敏试验

从陕西几个主要养鸡地区送检的280只病、死鸡中分离出132株大肠杆菌(Escherichiacoli),平均分离率为47.1%。以小鸡致病力试验筛选出60株具有致病力的E.coli,占分离菌的45.5%(60/132)。血清型鉴定有O_1,O_2,O_6,O_(20),O_(21),O_(22),O_(23),O_(26),O_(55),O_(74),O_(75),O_(76),O_(78),O_(89)计14种,其中O_(78)占25%(15/60),O_(89)15%(9/60),O_(75)13.3%(8/60),O_(74)10%(6/60),O_(21)10%(6/60)。其余各型相对较少,另有3株未定型。对13种抗菌素药敏试验以氟哌酸、卡那霉素高敏,庆大霉素、氯霉素、痢特灵中敏。药物的敏感性与菌株的来源有关(P<0.01),与血清型无关。

鸡源大肠杆菌某些生物学特性与致病力相关性研究

对陕西省主要养鸡地区病死鸡及死胚中分离的92株致病性大肠杆菌和12株非致病性大肠杆菌进行某些生物学特性与致病力相关性研究，其中包括血清型、溶血性，刚果红表型，盐凝集性，血凝性，D－甘露糖血凝抑制和科体抗性。结果表明大肠杆菌的致病力与血清型和溶血性无关，而与刚果红表型、盐凝集性和补体抗性呈明显正相关，可作为大肠杆菌致病力有无判定的实验室初步检测方法。

微量凝集试验检测鸡大肠杆菌抗体方法的建立及应用

建立了检测鸡大肠杆菌(E.coli)抗体的微量凝集试验法,所用抗原由制苗株制得。经方阵试验,抗原最适浓度为40亿菌/ml,反应最佳时间为4小时。攻毒试验表明凝集抗体效价在1:16时免疫鸡保护率耍达50%以上,且凝集抗体水平与保护力呈明显正相关。经E.coli多价油乳剂灭活苗免疫的青年鸡在免疫后42天平均抗体达7.25log2本法敏感性高、特异性强、染色抗原使结果判定更加客观和明显。为鸡大肠杆菌病的流行病学检查及免疫鸡群的抗体监测提供了条件。

鸡肾型IBV分离株M基因的克隆与特性分析

依据NCBI所登录的鸡传染性支气管炎病毒的M基因序列设计了一对引物,应用TRIzol试剂盒对8个肾型鸡传染性支气管炎病毒陕西地方分离株进行总RNA的提取,以所得到的RNA为模板,用RT-PCR对M基因进行扩增;其目的条带回收提纯后,与PMD18-T克隆载体进行连接,转化到DH5α宿主菌,并经药物抗性筛选、PCR及酶切鉴定,将所筛选鉴定出的阳性质粒进行测序,最后对测序结果进行分析。结果表明:陕西地方8个毒株(BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG)M基因长约为650 bp,其中YX、WH株本身无BamH 1酶切位点。WH与其它分离株的核苷酸同源性为91.8%～92.6%,而其它的分离株间的同源性为98.8%～99.8%。8个毒株与参考株的核苷酸同源性为74.9%～99.8%。其N端90 aa肽段与对照株相比,不同之处表现为高亲水性氨基酸取代低亲水性氨基酸,这会使其具有更好的抗原性。

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒（AIBV）分离株M蛋白的基因序列为基础，应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析；用Kyte-Doolittle方法、Jameson—Wolf方法、Karplus—Schulz方法、Plot—Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果，8株AIBV的M蛋白主要在10～40aa和90～175aa处存在无规律的点突变，与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87．4％～99．5％和96．3％～99．5％；分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91．8％～99．8％和95．4％～100％。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159～164aa和181～193aa肽段区（这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构）或其附近。结果表明，AIBV分离株的M蛋白基因相对保守，只存在无规律的点突变，该变异对AIBVM蛋白B细胞表位的稳定性无影响。

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。

鸡波德特氏菌病的研究

１９９５年９月在陕西咸阳首次发现鸡的波德特氏菌病。病鸡以流浆液性鼻液、眼睑肿胀、眼睛流泪及呼吸困难为特征。不同年龄的鸡均可感染，幼龄鸡的发病率和死亡率明显高于成年鸡。分离菌的２４ｈ肉汤培养物（０．２ｍＬ）感染小鼠及豚鼠可于２４ｈ内引起死亡；经鼻感染６０日龄鸡复制出了与自然病例相同的临床表现，病死率６０％，并回收到了接种菌。本文对分离的波德特氏菌的培养特性、形态特征、致病性、抗生素的敏感性、灭活苗的研制及免疫防制进行了深入研究。

中草药制剂防治鸡白痢病的研究

分别用３５ 味常用中药的水煎剂对鸡白痢沙门氏菌进行了抑菌试验，结果仅有石榴皮、地榆、诃子、泽泻、黄芩、金银花、黄柏、苍术、陈皮有一定的抑菌作用。以这些药物为主药组成的“白痢康”制剂对鸡白痢沙门氏菌抑菌效果明显。“白痢康”用于鸡白痢沙门氏菌人工感染鸡的预防和治疗，保护率达８８％ ～９０％ ，治愈率为７５％ ～８４．４％ ，并有明显的增质量效果；用于鸡白痢阳性父母代产蛋鸡的治疗，可使鸡白痢的阳性率由１００％ 降低到１３．３％ 以下，同时能提高鸡的产蛋率和降低死淘率。

基于B/S的奶牛主要疫病诊断专家系统的建立

为了提高基层兽医和养殖管理人员对奶牛主要疫病的诊断水平,辅助兽医进行奶牛主要疫病诊断,使专家的知识和经验得到最大程度的利用,解决基层兽医从业人员短缺和疾病诊断准确率低的问题,同时,为奶牛疫病预警系统提供高质量的基础数据,并增进广大养殖企业和兽医人员与专家之间的交流,我们设计了奶牛主要疫病诊断专家系统。该系统基于B/S(Browser/Server)模式,结合奶牛疫病和专家系统的研究成果,应用JSP+Tomcat+MySQL等软件进行设计。系统可实现奶牛主要疫病的在线诊断和查询,同时用户可就生产中遇到的问题与专家进行在线实时交流。

病死雏鸡的病原分离鉴定

从送检的３１只病死雏鸡中分离出３０株致病菌，其中沙门氏杆菌２７株，分离率９０％，大肠杆菌６株，分离率２０％。对其中５株沙门氏杆菌和４株大肠杆菌进行了系统生化鉴定及血清型鉴定，证实５株沙门氏菌中鸡白痢沙门氏杆菌占６０％（３／５），鸡伤寒沙门氏杆菌占４０％（２／５），４株大肠杆菌中Ｏ２２株，Ｏ６１株，Ｏ１１５１株。对分离菌进行了雏鸡致病力及抗菌药物敏感性试验。

强毒鸡新城疫病毒的分离鉴定及免疫防制研究

从陕西发病鸡群中分离出8株病毒,分离毒大多为速发型NDV强毒株,对经典NDVLaSota株免疫的雏鸡及52周龄高抗体母鸡仍有强的致病力。采用NDVSH1-SH8毒株制备成多价油乳剂灭活苗,免疫鸡群有良好的保护力。

奶牛乳头专用消毒剂消毒效力研究

通过对MEDPH奶牛乳头专用消毒剂进行实验室消毒试验、现场消毒试验及同类产品的对比试验,测定了其杀菌效果。实验室消毒试验表明,MEDPH奶牛乳头专用消毒剂使用液(含有效碘0.04％)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌的最低杀菌浓度分别为0.01％(使用液4倍稀释)、0.01％(使用液4倍稀释)、0.02％(使用液2倍稀释);最快有效时间为15s,杀菌率达99.99％,杀灭指数大于10 4。现场消毒试验表明,该消毒剂使用液对奶牛乳头表面细菌杀菌率达99.99％,杀灭指数大于10 4,且对奶中乳头无不良反应,安全可靠。对比试验表明:其杀菌效果和使用效果均优于"碘伏",与"滴宝"效果相当。