棉花现代品种资源产量与纤维品质性状鉴定及分子标记评价

棉花是重要经济作物和天然纺织工业原料。品种是棉花生产的限制性源头,取决于优异种质资源的鉴定、评价和有效利用。鉴于此,本研究以我国三大棉区(黄河流域棉区、长江流域棉区和西北内陆棉区) 141份陆地棉现代品种资源为材料,在不同环境条件鉴定其9个产量与纤维品质性状,并结合KASP和SSR标记对其进行遗传多样性评价。结果发现,长江流域棉区品种的衣分和衣指最高,黄河流域棉区品种的单铃重和子指最大,西北内陆棉区品种的纤维品质最优;同时发现,4个产量性状与5个纤维品质性状在供试品种间存在极显著差异,产量性状以衣指的变异系数最大(10.09%),品质性状以断裂比强度的变异系数最大(8.81%),说明存在较大选择潜力。依据9个性状进行聚类分析,可将141份品种资源分为2类,且类别间的产量与品质性状存在差异。分子标记检测发现, 30对SSR引物在141份品种资源中扩增出74个多态性条带,32个KASP标记在供试品种中分型清晰,依据标记计算品种的遗传相似系数均值为0.62,说明存在较丰富遗传变异;分子标记聚类分析将供试品种分为2类,且分类结果与表型性状分类结果有一定相似性。本研究共筛选出3份大铃(>7 g)优异种质、24份高衣分(>42%)种质、6份纤维长度和断裂比强度>30的种质以及2份综合性状优异种质,为棉花新品种培育提供了优异亲本资源,为深入利用棉花品种资源提供了依据。

不同种植环境下国内外棉花种质资源的遗传多样性分析与评价

目前,我国棉花育种存在着现有品种同质性高,种质资源遗传多样性下降,优异基因资源挖掘不足等问题。鉴于此,本研究以来自我国三大棉区(黄河流域棉区、长江流域棉区和西北内陆棉区)与国外的415份棉花种质资源为材料,在海南三亚、河北河间和河北辛集3个环境下,对3个产量性状指标和7个纤维品质指标进行鉴定和综合评价。结果发现,三亚单铃纤维重和衣分值最高,纤维品质最差,河间单铃重最高,纤维品质最佳,辛集产量性状最差;同时发现,10个表型性状在3个环境下变异系数较大,且具有丰富的遗传多样性。不同来源棉花种质资源除纤维长度、整齐度及短纤维率外均存在显著差异,黄河流域棉区种质资源产量性状最好,纤维长度和断裂比强度最高,且大于“双30”的材料占比最多,但马克隆值偏高;长江流域棉区的单铃纤维重和衣分较高;国外种质资源铃重较高,衣分最低。相关性和聚类分析结果表明,产量性状之间多呈正相关,供试种质资源被分为5类。通过因子分析法对供试材料进行综合排名,筛选出7份大铃(>7 g),26份高衣分(>42%),11份纤维长度与断裂比强度均大于“30”的种质资源,以及9份综合性状表现优异的资源,为棉花育种提供了优异亲本材料,也为进一步开展研究提供了重要依据。

陆地棉抗黄萎病基因GhENODL6互作蛋白筛选

研究发现陆地棉ENODL6基因具有抗黄萎病功能。为进一步揭示其在棉花抗黄萎病过程中发挥的作用,通过Nimble Cloning技术将GhENODL6插入酵母表达载体pNC-GBKT7,构建了重组质粒pNC-GBKT7-ENODL6。重组质粒转入酵母菌Y2HGold后可在DDO培养基上正常生长,但不能生长于QDO/X/A培养基,表明GhENODL6蛋白对酵母宿主无毒害作用,没有自激活活性。将携带pNC-GBKT7-ENODL6诱饵载体的Y2HGold酵母菌与cDNA文库进行杂交筛选,结果获得一个能够显示蓝色的菌落。通过PCR扩增,在蓝色酵母菌中获得一段526 bp的非载体插入片段,与陆地棉基因组内基因WRKY47序列高度一致。通过同源扩增,从陆地棉中克隆到WRKY47开放读码框,全长1 587 bp,编码528个氨基酸残基。再次利用酵母双杂交技术确认了WRKY47与GhENODL6之间存在互作关系。综上,构建了重组载体pNC-GBKT7-ENODL6,并鉴定到与GhENODL6互作的蛋白WRKY47。

陆地棉纤维强度KASP-SNP标记的开发及效应评价

纤维强度(fiber strength,FS)是判断棉花纤维品质优劣的重要指标之一,开发可用于目标性状选择的分子标记将会大大提高选择准确性并加快育种进程。设计KASP引物,对国内外的376份品种(系)进行基因型鉴定,筛选多态性标记并验证其对高强纤维材料选择的有效性。3个SNP位点在材料中均具有多态性,标记FS-15对高强纤维材料的选择率为63.2%,FS-16和FS-29分别为60.0%和56.1%。对单倍型组合(Hap1、Hap2、Hap3和Hap4)的有效性评价表明,携带Hap3(TTA)的材料纤维强度显著高于其他组合,对高强纤维材料选择率达72.7%。此外,Hap3对纤维长度、铃重、籽指和衣指无不利影响。以上结果表明,开发的KASP标记及Hap3可用于高纤维强度材料的辅助选择,同时未对纤维长度、铃重、籽指和衣指等性状产生不利影响。

我国棉花抗枯、黄萎病骨干品种(系)基于AFLP的遗传多样性

利用AFLP分子标记技术,对我国20世纪50年代开展抗枯、黄萎病育种以来培育的105份骨干品种(系)的遗传多样性进行了研究。结果表明,筛选的20个AFLP引物组合在该品种群体中扩增了1498个AFLP标记,其中多态性标记232个,占总标记数的15.5%。单一引物组合扩增的DNA标记数变化在49111之间,平均每个引物组合扩增的总标记和多态性标记分别为74.9和11.6。在该抗病品种群体中,有46个品种(系)具有特异标记,占品种总数的43.81%,其中引物组合E41/M50可使10个品种产生特异标记。品种(系)之间的成对欧氏距离总平均值为4.353,变幅为1.7326.708,单一品种欧氏距离平均值变幅为3.5315.705,高于总平均值的品种数不足50%,表明该陆地棉抗病品种群体的遗传多样性较低。基于AFLPs多态性数据的聚类分析,105个品种(系)被划分为5个陆地棉品种类群(Uplandcottongroups,UCGs),每个UCG包含的品种数目不同。

黄河、长江流域棉区棉花抗病品种的AFLP分析

选取黄河流域棉区的 72个抗病品种和长江流域棉区的 2 9个抗病品种 ,利用AFLP技术对其进行了遗传多样性分析。结果 2 0对具有多态性的AFLP引物组合在黄河流域棉区的 72个品种和长江流域棉区的 2 9个品种上分别扩增出 2 0 0条和 12 7条多态性带 ,利用SPSS(11 0 )软件计算得到品种之间的平均欧氏距离为 4 .35 6 (黄河流域棉区 )和 4 391(长江流域棉区 )。在阈值取 15 2时 ,可以将黄河流域棉区的 72个品种划分为 4个类群 (theHuanghevalleygroups ,abbreviateHVGs) ,即HVG1、HVG2、HVG3和HVG4 ,分别包括 2 7、19、10和 16个品种 ;长江流域棉区的 2 9个品种被划分为 4个类群 (theChangjiangvalleygroups ,CVGs) ,即CVG1、CVG2、CVG3和CVG4 ,分别包括 14、4、5、和 6个品种。通过比较两棉区品种成对欧式距离的最大值、最小值、平均值及成对欧氏距离的区间分布和累积百分率 ,表明来自黄河。

黄萎病菌诱导下陆地棉抗病品种SSH文库的构建

采用抑制差减杂交技术,构建了陆地棉抗病品种冀棉20经黄萎病菌诱导8h、12h、24h、48h后的混合SSH文库,文库共包含800个阳性克隆。对质粒的酶切和巢式PCR结果表明,插入片段大小平均为400bp。随机挑选20个阳性克隆进行测序,利用BLASTn和BLASTx进行序列相似性分析,发现20条EST都可以找到功能已知的同源序列,其中在BLASTn比较结果中,功能已知的有12条,占全部EST的60%;BLASTx的比较结果中有14条功能已知,占全部EST的70%。这些同源序列涉及到10种与抗病防御相关的基因,包括丝氨酸/苏氨酸激酶、谷胱甘肽-S-转移酶、乙醇脱氢酶、细胞色素P450、ACC氧化酶等。将这些序列与GenBank dbEST库进行比对,发现75%的EST都可以找到同源性较高的序列,它们都来自于植物在生物与非生物胁迫条件下特异表达的cDNA文库,这些胁迫包括病原菌诱导、低温处理、紫外线照射、热激处理、盐处理、氧胁迫、水杨酸诱导等。

陆地棉黄萎病抗性的遗传研究

以7个陆地棉品种配制的6个组合的P1，P2，F1，F2，BC1，BC2群体和6个组合的P1，P2，F2群体为材料，接种菌系采自于河北省棉区的2个中等致病力菌系（VJ25和VJ17），在人工生长室条件下研究了陆地棉的黄萎病抗性遗传方式。结果表明，陆地棉品种93抗12、彭泽70和苏2028具有对中等致病力菌系的抗性。在抗、感材料杂交分离群体中，抗、感植株的分布表现为主基因控制的质量遗传分布特征。遗传分析表明，上述3个品种的黄萎病抗性受2个显性互补基因控制。

高纤维强力棉花种质系苏远7235 BAC文库的构建

苏远7235是我国利用异常棉等多个野生种创造的高纤维强力棉花种质系,是开展棉花纤维品质研究的重要材料。本研究以pIndigoBAC-5(HindIII-cloning ready)为载体,构建了苏远7235的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文库,该文库包含30336个BAC克隆。分析结果表明,重组克隆苏远7235 DNA插入片段为50-140 kb,平均120 kb,空载率2.1%,89.6%的克隆插入片段大于100 kb。

海岛棉品种抗黄萎病基因SSR标记的验证及克隆

以陆地棉与海岛棉杂交组合中棉所8号×Pima90-53 F2群体的100个单株和邯208×Pima90-53 F2的131个单株为材料,在条件可控的培养室鉴定抗病性,进行海岛棉黄萎病抗性基因连锁SSR标记(BNL3255-208)分析,进一步检验该标记的应用价值,并对该标记进行克隆、测序。结果表明,2个组合的F2群体中抗病、感病植株比例经x2c适合性测验均符合3∶1分离比例;中棉所8号×Pima90-53 F2的79个抗病单株中有70株检测出BNL3255-208标记,抗病单株中有该标记的百分率为88.6%,邯208×Pima90-53 F2的100个抗病单株中有85株检测出BNL3255-208标记,抗病单株中有该标记的百分率为85.0%。通过回收BNL3255-208片段,并进行克隆和测序,表明该标记是一条长211bp、含10次TG重复的片段,该标记为辅助选育抗病品种奠定了基础。

转基因抗虫棉SSR和AFLP遗传变异研究

利用SSR和AFLP两种分子标记技术,分析了52份转基因抗虫棉品种(系)的遗传多样性。结果表明:在61对SSR引物中,有4对引物在供试材料中表现出多态性,共扩增出102个标记,其中多态性标记25个,多态性百分率为24.51%,每对引物的扩增带数变化在17～30之间;在100对AFLP引物中,有9对引物在供试材料中产生多态性,共扩增出618个标记,多态性标记33个,占总数的5.34%,每对引物组合扩增的标记数分布于47～81之间。成对品种的欧式距离变化在2.00～5.57之间,平均值为4.21,单一品种欧氏距离的平均值分布在3.73～4.75之间,表明不同品种之间遗传差异不大。基于SSRs和AFLPs多态性数据的聚类分析,可以将供试材料划分为3个类群(SAGs),但类群划分与品种地理来源不十分吻合。

以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪轰击转化的研究

以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪遗传转化,在不受宿主基因型范围和操作时间的限制等方面优于农杆菌介导法和花粉管通道技术。影响棉花茎尖分生组织基因枪遗传转化率的因素较为复杂,轰击前,外植体制备需考虑茎尖分生组织的取材时间、下胚轴保留的长度、外源生长调节剂及活性炭的使用量,以保证其正常生长;轰击后,抗生素筛选的浓度、筛选培养基的转换时间和抗性苗的壮苗也会影响转化效率;此外,DNA和钨粉或金粉的质量、基因枪参数及操作等对转化效果都有一定的作用。除对影响茎尖分生组织基因枪转化率的因素分析以外,还对近年来在棉花茎尖分生组织遗传转化中的最新动态进行了综述,并对目前存在的问题加以讨论。

一种新的棉花黄萎病抗性鉴定方法

介绍了一种新的快速鉴定棉花品种抗黄萎病的方法——六棱塑料钵定量注菌液法 ,与传统的鉴定方法相比具有以下优点 :1使用有底的六棱塑料钵 ,灭菌后可以重复使用 ,减少了制作营养钵的工作量 ,而且其造型有利于棉苗根系下扎生长。2以价格低廉、通透性好、一次性使用、经高温灼烧的蛭石填充营养钵作生长基质 ,可免去灭菌消毒工序 ,也有利于棉苗根系生长发育。3种子催芽技术出苗整齐、生长健壮 ,每钵只种 1～ 2棵棉苗 ,减小了寄主个体间的竞争。4用六棱营养钵培育棉苗时 ,棉苗根系生长健壮且须根紧贴塑料钵内壁生长 ,采用先用粗铁丝定点伤根再定量注菌液的方法 ,有利于病菌的侵入 。

细菌人工染色体文库及其应用

细菌人工染色体是１９９２年以来发展起来的一种新型克隆载体，用于构建人、动物、植物核基因组ＤＮＡ大片段插入文库。细菌人工染色体在文库构建中具有转化效率高、构建文库简单、嵌合体少、插入片段容易回收、在寄主细胞中插入片段稳定性好、插入片段较大等优点。细菌人工染色体文库的构建对于基因组较大的真核生物基因组学研究具有重要作用，该文库可用于真核生物重要性状基因及全基因组的物理作图、重要农艺性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析等研究。本文主要综述了细菌人工染色体文库的构建及其在图位克隆基因、荧光原位杂交、全基因组物理作图等研究中的应用进展。

过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究

对 2 0个来源及抗性不同的海岛棉和陆地棉品种和 2个陆地棉 ( S) /海岛棉 ( R)杂交组合的亲本、F1、 F2 世代的 POX同工酶研究表明 ,接种黄萎病菌前后 ,棉花叶片中的 POX同工酶酶谱发生明显变化 ,抗病品种与感病品种的阴性 POX同工酶谱带均由原来的 3条增至 6条 ,但两者之间不存在明显差异 ;阳性 POX同工酶谱带接种前后均只有 1条 ( POX- PC1) ,抗病品种接种前后该酶带无明显变化 ,而感病品种接种后活性增强。遗传分析表明 ,海岛棉对黄萎病的抗性和 POX- PC1酶带基因具有显性单基因遗传特征 ,并推测 PC1基因受抗病基因调控 ,在生化水平上进一步证明海岛棉抗性为显性单基因遗传。POX在棉花抗黄萎病中的作用并非十分重要 ,但 PC1酶带的表现与棉株黄萎病抗性显著相关 ,PC1酶带弱 ,棉株抗病 ,PC1酶带强 ,棉株感病 ,从而证明 POX-

棉花分子遗传图谱构建和纤维品质性状QTL分析

以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中棉所8号和海岛棉(Gossypium barbadense L.)Pima90-53组配衍生的214个单株的F2群体为材料,构建了包含110个SSR标记和65个AFLP标记的遗传连锁图谱。该图谱共包括42个连锁群,连锁群长度为4.5～147.3cM,包括2～22个分子标记,标记间平均距离为11.6cM,总长为2030cM,约占棉花全基因组的40.6%。应用复合区间作图法分析该组合的F2单株和F2:3家系纤维品质性状,共得到25个纤维品质数量性状基因座(QTL),其中5个与纤维长度相关,分布在Chr.21、Chr.15、LG2和LG12上,可解释表型变异的10.2%～35.8%;4个与整齐度相关,分布在Chr.21、LG9、LG18和LG12上,可解释表型变异的12.6%～36.6%;7个与马克隆值相关,分布在Chr.9、LG1、LG9、LG20和LG12上,可解释表型变异的11.5%～26.1%;7个与断裂比强度相关,分布在Chr.21、Chr12、Chr.8、LG1、LG4和LG10上,可解释表型变异的16.5%～52.8%;2个与伸长率相关,分布在Chr.9和Chr.21上,可解释表型变异的18.1%和27.1%。LG9、LG12和Chr.21上存在QTL聚集区。

河北省西瓜枯萎病菌生理小种鉴定与AFLP分析

【目的】明确河北省西瓜枯萎病菌生理小种类型和遗传多样性,为西瓜抗病育种和西瓜枯萎病的综合防治提供依据。【方法】本文对采自河北省12个西瓜种植地区的46个西瓜枯萎病菌菌株和4个已知生理小种的菌株进行了致病性测定和AFLP分析。【结果】根据菌株对3个鉴别寄主表现出的致病性强弱,将河北省46个西瓜枯萎病菌菌株划分为3个不同的生理小种,即0号、1号和2号,分别占供试菌株的17.4%、65.2%和17.4%,其中1号生理小种为优势小种,分布在河北省所有西瓜种植区。21对AFLP引物对供试菌株扩增出1157条带,其中多态性带389条,占总带数的33.6%。河北省西瓜枯萎病菌的遗传距离变化在0.33～0.95之间,平均为0.66,群体遗传多样性比较丰富。基于AFLP标记聚类分析表明,50个菌株被划分为3个类群(AFLP Groups,AGs)。AGI包含4个菌株,均为2号生理小种;AGII包括4个菌株,均为0号生理小种;AGIII包括42个菌株,以1号生理小种为主(32个),占该类群的76.2%。【结论】河北省西瓜枯萎病菌存在明显的致病性分化,其AFLP类群划分与致病性鉴定划分的生理小种之间存在一定相关性,但与菌株的地理来源无关。

河北省棉花黄萎病菌致病性的研究

在棉花苗期采用塑料营养钵底部定量注菌液法接种，于昼温２５～２６℃，夜温２０～２２℃的人工培养室中测定了自河北省重点植棉县分离的４０个棉花黄萎病菌单孢菌系和外地５个菌系的致病性。以中棉石系亚、海岛棉海７１２４、陆地棉９３抗１２、辽棉５号、冀棉１１号、农大３６５６个品种为鉴别寄主，以病情指数作为划分抗、感类型的标准，根据在鉴别寄主上的反应，４５个供试菌系可被划分为致病力强的Ⅰ型、致病力中等的Ⅱ型和致病力弱的Ⅲ型，分别占５３．５％、２８．９％、１７．８％。Ⅰ型菌系除使中棉表现抗（耐）病外，海岛棉和陆地棉均表现感病。该类菌系遍布冀中南棉区，其中有７个菌系可使部分品种表现落叶，证明河北省已有落叶型菌系存在。试验还表明，海７１２４、９３抗１２、冀棉１１号和农大３６５４个棉花品种对黄萎病鉴别力较强。

不同来源海岛棉品种黄萎病抗性遗传研究

以国内外 4个来源不同的海岛棉品种与我国育成的 8个陆地棉品种组配的 32个不同类型的杂交组合为材料 ,在人工生长室条件下 ,用 4个不同致病力类型黄萎病菌系于棉花苗期接种 ,进行了海岛棉黄萎病抗性的鉴定和遗传研究。结果表明 ,海岛棉品种 Pima90 - 53(美洲型 )、Giza70 (埃及型 )、 50 10 F和吐海 2号 (中亚埃及型 )具有对强致病力类型和中等致病力类型黄萎病菌系的抗性 ,这些黄萎病抗源在与我国陆地棉品种杂交的遗传背景下 ,其抗性为由显性单基因决定的质量遗传性状。用中棉所 8号与吐海 2号 1个组合初步证明正、反交结果相同 ,吐海 2号的抗性不存在母本效应。等位性测验表明 。