马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。

马病毒性动脉炎病毒数字PCR方法的建立

在马病毒性动脉炎病毒(EAV)基因组序列的高度保守区域ORF7上设计引物和探针,对反应体系中的条件进行优化,验证其灵敏性、特异性、重复性,建立了马病毒性动脉炎病毒数字PCR方法(digital PCR,dPCR)。结果显示,建立的EAV数字PCR方法在退火温度为58℃、引物终浓度为0.9μmol/L和探针终浓度为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;该方法与马泰勒虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒均无交叉反应;最低检测限为0.16 copies/μL;组内及组间变异系数均在2.5%之内;通过对234份临床样本进行dPCR检测,阳性检出率为15.81%,高于实时荧光RT-PCR方法检出率(14.1%)。结果表明,建立的dPCR能快速、精准定量EAV在样本中的病毒载量,可用于马病毒性动脉炎病毒的早期检测。

多重PCR检测奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体

为了建立同步检测奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体感染的多重PCR方法,根据GenBank上具有属间特异性的布鲁菌.Bp26基因、鹦鹉热衣原体23S rRNA基因和贝纳氏柯克斯氏体IS1111a基因,利用Primer premier 5.0软件各设计1对特异性引物。通过优化PCR反应体系和扩增条件,建立了能够同时检测奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体的多重PCR方法。该方法具有较好的特异性和可重复性,对3种基因单重PCR检测敏感性均达到3.1×10~2拷贝·反应^-1,对3种病原基因同步检测的敏感性能达到3.1×10~3拷贝·反应^-1。利用该方法对采自不同流产牛的抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液等172份临床样品进行检测,检测到布鲁菌感染阳性样品53份,鹦鹉热衣原体感染阳性样品2份,贝纳氏柯克斯氏体感染阳性样品10份,且检测到布鲁菌和鹦鹉衣原体混合感染阳性样品2份,布鲁菌和贝纳氏柯克斯氏体混合感染阳性样品2份,尚未检测到3种病原混合感染的阳性样品。结果表明,建立的多重PCR方法可以用来对奶牛布鲁菌、鹦鹉热衣原体和贝纳氏柯克斯氏体进行同步、快速、灵敏的检测。

枣实蝇气味结合蛋白基因的克隆及表达谱分析

【目的】克隆枣实蝇Carpomya vesuviana Costa气味结合蛋白(odorant binding protein,Cvco OBP)基因,对其表达谱进行分析,为枣实蝇气味结合蛋白的深入研究奠定基础。【方法】对枣实蝇头部RNA进行转录组测序,通过蛋白序列比对以及构建系统进化树分析枣实蝇OBP序列,运用半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction,sqRT-PCR)方法对获得的Cvco OBP序列进行组织表达特异性研究。【结果】转录组测序后共获得7个OBP,命名为(Gen Bank登录号分别为:KU975053、KU975054、KU975055、KX059394、KU975056、KX059395、KX059396)。对Cvco OBP1-7进行蛋白序列比对发现,Cvco OBP1、Cvco OBP3、Cvco OBP4、Cvco OBP6、Cvco OBP7是典型的OBP家族成员,具有6个高度保守的半胱氨酸残基;Cvco OBP2和Cvco OBP5属于"Minus-C"家族成员,具有4个高度保守的半胱氨酸残基。系统进化分析结果显示,Cvco OBP1-7分别与不同的OBP有较近的进化关系。半定量PCR检测结果发现,Cvco OBP1-7在枣实蝇腹部、头部及胸部都有表达,且表达量较高;Cvco OBP1、Cvco OBP2在翅中有表达,但表达量相对较低;Cvco OBP1、Cvco OBP5、Cvco OBP6在足中也有表达,但表达量相对较低。【结论】获得并分析了7个Cvco OBP,不同Cvco OBP表达部位和表达量各不相同;Cvco OBP1-6分别属于OBP56g,OBP8a,OBP83a,OBP56h,OBP99c,OBP83ef类型。

蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。

牛新孢子虫基因芯片检测方法的建立

为建立牛新孢子虫准确快速检测方法,本研究根据犬新孢子虫NcSAG1基因、Nc5基因和NcSRS2基因,以及弓形虫GRA6基因和牛性腺基因,设计合成相应的5对引物和5条芯片探针,以牛性腺基因为内标监控基因,进行芯片杂交试验,经反应条件的优化,建立了含监控内标,可对新孢子虫3个基因进行同步检测,并可与弓形虫GRA6基因进行区分检测的基因芯片检测方法.该方法对新孢子虫的最低检测限分别为102拷贝/μL,并且具有良好的特异性和重复性.利用建立的方法对157例临床样品进行检测,与普通PCR检测结果符合率为99.3 ％～98％.该方法的建立为新孢子虫等多病原高通量检测方法的研究奠定基础.

四种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA试剂盒检测猪血清样本的质量评估

[目的]对4种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA试剂盒进行质量评估。[方法]用4种商品化的口蹄疫非结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒,对非免疫无疫、免疫健康、免疫感染和非免疫人工感染4种类型猪血清样本进行检测,分析试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性、分析敏感性、分析特异性及重复性。[结果]4种试剂盒的诊断敏感性在76.8%~94.4%之间,诊断特异性在97.7%~100%之间,分析敏感性和分析特异性较好。4种检测试剂盒与4种猪常感染疾病的阳性血清不发生反应。试剂盒的批间重复性为(10.545±6.845)%^(37.577±28.626)%;批内重复性为(9.037±6.075)%^(37.601±27.027)%。[结论 ]在实际应用中,需根据检测目的不同,选取相应的试剂盒。

牛病毒性腹泻病毒内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法,本研究根据BVDV 5＇-UTR区序列设计引物和荧光标记探针,通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）扩增获得内标模板,经体外转录得到可以作为内标物的cRNA。经反应条件的优化,建立了BVDV内标双重TaqMan荧光RT-PCR检测体系。结果表明：当cRNA浓度为103拷贝/μL时,二者均有较好的扩增曲线;该方法对I型BVDV的检测灵敏度为0.25 TCID50,对II型BVDV的检测灵敏度为2.5 TCID50;利用该方法对猪瘟病毒等其他相关核酸的检测结果均为阴性;重复性检测Ct值变异系数为0.54~4.73。对506份临床样品检测,结果有23份样品为阳性,阳性样品检出数量和编号与不含内标的单一荧光RT-PCR方法完全一致,表明该方法可以用来对BVDV进行准确、快速检测,并且可以对检测结果进行质量监控。

蜜蜂蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病(EFIB)病原菌蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)的方法,本研究根据M.pluton 16S rRNA基因序列,设计并合成特异性引物和TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测M.pluton TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法与其它蜜蜂常见病病原均无交叉反应;该方法的灵敏度为1.0×10~1拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏1 000倍;重复性试验表明该方法的批内和批间变异系数均小于1%。应用该方法对100份实验室模拟样品和150份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可为蜂及蜂产品中M.pluton的检验检疫提供新的、有效的技术手段。

马疱疹病毒1型QuantStudio^TM 3D数字PCR检测方法的建立

试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1(EHV-1)3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防。根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法。本研究建立的3D-dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均<3.2%;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7%,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2%。3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品。本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测。

阿魏菇粗多糖体外脾细胞调节功能及体内疫苗佐剂功能的研究

为研究阿魏菇粗多糖(PFCP)体外对小鼠脾细胞增殖的作用和体内对口蹄疫灭活疫苗的佐剂功能,MTT法检测PFCP最大无毒浓度,PFCP与Con A、LPS联用刺激小鼠脾细胞增殖的能力,ELISA检测细胞培养上清中IL-4与IFN-γ含量。PFCP联合口蹄疫病毒灭活抗原皮下注射免疫接种小鼠,ELISA检测IgG生成情况,流式细胞术分析免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例。结果显示,PFCP安全性好,体外可协同ConA与LPS促进小鼠脾细胞的增殖,增加IL-4与IFN-γ的分泌量。体内可增强口蹄疫病毒特异性IgG的水平,增加CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量。表明PFCP对小鼠脾细胞增殖具有较好的促进作用,且具有作为口蹄疫灭活疫苗佐剂的潜力。

幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为快速鉴别诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American foulbrood,AFB)和欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood,EFB),本研究根据Gen Bank中登录的幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)和蜂房蜜蜂球菌(Melissiciccus pluton)16S r RNA基因序列分别设计特异性引物和探针,建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法与其他病原无交叉反应;对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10 copies/μL的阳性质粒;重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2%。应用该方法对200份实验室模拟样品和200份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于AFB与EFB的快速鉴别诊断和早期监测,以及蜂产品中P.larvae和M.pluton的定量分析。

4种口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒的质量评估

为了对4种检测牛口蹄疫非结构蛋白抗体商品化ELISA检测试剂盒进行质量评估,试验采用4种试剂盒分别对非免疫无口蹄疫区、免疫无口蹄疫区、免疫健康、免疫感染和非免疫人工感染的5类不同类型牛血清样本进行检测,对试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性、分析敏感性、分析特异性及重复性进行分析。结果表明：4种试剂盒的诊断敏感性为87.9%-100%,诊断特异性为81.8%-100%。经ROC曲线分析,曲线下面积（AUC）值为0.996-1.000。分析敏感性和分析特异性较好,与其他阳性血清不发生交叉反应。试剂盒的批内变异系数为（5.296±1.745）%-（21.653±3.789）%;批间变异系数为（13.436±13.663）%-（21.729±3.404）%。与酶联免疫电转移吸附试验（EITB）比较,Kappa值显示除试剂盒D为中度符合外,其余试剂盒均高度符合。综合分析试剂盒A诊断敏感性、分析敏感性、分析特异性、诊断特异性和重复性均较好,试剂盒B与试剂盒C的诊断特异性和诊断敏感性较好。

蜜蜂白垩病病原的分离与鉴定

为了解伊犁河谷蜜蜂白垩病的流行情况及研究快速诊断方法,本试验开展了该病的流行病学调查,并将50份疑似样品处理后采用分离培养法、镜检法及PCR法对病原菌进行了分离与鉴定。结果5份为阳性,阳性率10%,培养基菌落颜色呈白色,较致密,中央凸起,老化菌落颜色呈浅棕色至棕色;镜检可见树枝状分枝的有隔菌丝,二叉分枝间距较大,菌丝体呈疏松的蛛网状,用乳酸棉监染色液染色后菌丝为蓝色;PCR反应结果为阳性,阳性结果测序后所得序列用Blast软件比对,与球囊菌属的蜜蜂球囊菌基因序列相似性最高,达到99%。上述结果表明,从伊犁河谷病蜂中分离的病原菌为蜜蜂白垩病病原。

吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱的监测与鉴定

目的为防止有害媒介生物通过国际贸易传入我国,对进口羊毛进行蜱监测与鉴定。方法采集2017年9月至2018年6月新疆维吾尔自治区吐尔尕特口岸从吉尔吉斯共和国进口的16批次羊毛,对其进行蜱检疫。将检出的蜱进行形态学鉴定,通过提取其基因组DNA,扩增线粒体16S rRNA基因、18S rRNA基因以及细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因并测序,利用MEGA 7.0软件构建系统发育树对其进行分子生物学鉴定。结果从吉尔吉斯共和国进口的16批次羊毛中有11批次检出蜱。共检出蜱39只,其中活体1只。经形态学和分子生物学鉴定,隶属2科4属5种,分别为拉合钝缘蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、刻点血蜱和具沟血蜱。其中具沟血蜱30只,占截获蜱总数的76.9%,为吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱的优势种类;活体蜱为拉合钝缘蜱若蜱。结论吉尔吉斯共和国进口羊毛携带蜱的概率较高,以具沟血蜱为主,且首次从进口羊毛中检出拉合钝缘蜱若蜱活体。因此,从吉尔吉斯共和国进口羊毛要加强对蜱的检疫,防止病媒生物入侵,严防疫病传入。

新疆两盐湖可培养极端嗜盐菌组成及功能多样性研究

【目的】通过分析不同成盐类型盐湖中的极端嗜盐菌群落组成差异,探究可培养极端嗜盐菌的功能特性。【方法】采集新疆硫酸盐型盐湖七角井和碳酸盐型盐湖南湖的土壤样品,通过平板稀释涂布法分离极端嗜盐菌,经过形态学观察、特征分析获取代表菌株,通过耐盐性测定和16S rRNA基因序列测序等对代表菌株进行鉴定,并对极端嗜盐菌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶活性进行筛选,同时检测苯酚降解能力。【结果】本研究共获得1679株极端嗜盐菌,代表菌株45株,隶属于5门14个属,古菌数量(70.58%)明显多于细菌,最优盐浓度生长范围为18.4%–20.0%。在属水平上,盐湖中优势类群为古菌的Haloterrigena属(32.94%)和Natrialba属(26.03%),以及细菌的Aquisalimonas属(9.85%)和Aliifodinibius属(8.10%)。两盐湖中,盐度较低的南湖物种丰富度高于七角井盐湖,古菌物种组成相似,均以Haloterrigena属为主;细菌群落组成有差异,南湖以Aquisalimonas属为主,而七角井以Aliifodinibius属为主。功能筛选表明,盐湖中80%的嗜盐菌功能筛选至少有一种为阳性,产淀粉功能酶菌株占42.58%,多属于Natrialba属。产蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶的菌株分别占9.71%、9.29%和7.21%,降解苯酚菌株占11.14%。【结论】本研究揭示了新疆盐湖中可培养极端嗜盐菌的多样性,古菌是优势菌群,细菌种类多样,菌株各类功能酶活性显著,同时,优势的Natrialba、Haloterrigena、Aquisalimonas和Aliifodinibius属菌株均极具应用潜力,可为今后研究应用提供和丰富了菌种资源,具有较大的挖掘潜力。

马疱疹病毒4型QuantStudio^TM 3D数字PCR检测方法的建立

旨在建立一种高灵敏度的检测马疱疹病毒4型的3D数字PCR(3D-dPCR)方法,为马鼻肺炎的早期诊断提供技术支持。通过优化3D-dPCR反应体系中引物和探针的浓度和退火温度,评估其灵敏性、特异性、重复性。结果显示,建立的3D-dPCR方法中引物和探针的最佳浓度分别为0.4、0.13μmol/L,最佳退火温度为60℃。该方法的R^2为0.9964,具有良好的线性关系,灵敏度高,最低检测限为5.4 copies/μL;与马疱疹病毒1型、马泰勒虫、马动脉炎病毒的核酸无交叉反应;RSD小于5%。结果表明,本研究中建立的3D-dPCR方法灵敏度高、特异性强,可作为马疱疹病毒4型定量检测的方法。

采用物理消毒机对室内空气中自然菌的预防性消毒效果评价

本文对全离子双风道空气物理消毒机进行物理消毒后室内环境空气中的自然菌消毒效果进行评价。依据WS/T 774-2021《新冠肺炎疫情期间现场消毒评价标准》和《消毒技术规范》,在密封环境常温条件下进行预防性消毒,消毒后的1 h、2 h和4 h对空气中自然菌采用撞击法和自然沉降法进行采样并检测,不同消毒时间的消毒效果存在显著性差异。自然沉降法和撞击法测得消杀4 h后的自然菌消亡率分别为90.63%和90.28%,两种方法采集的自然菌结果均可达到消毒合格指标。评价结果表明,全离子双风道空气物理消毒机对室内环境预防性消毒效果明显。