不同伤情血清可有效激活IEC-6细胞PI3K/Akt通路

目的检测不同伤情血清对肠上皮细胞PI3K/Akt通路的激活。方法将对数生长期的IEC-6细胞无血清培养基培养24 h后,加入单放、单烧和复合伤24 h大鼠血清,并设正常大鼠血清组和无血清组作对照,刺激12 h后检测细胞AKT磷酸化水平。利用SELD I(surfaced enhanced laser desorption/ion ization)蛋白质芯片技术对单放、单烧、复合伤24 h大鼠血清差异蛋白进行筛选和分析。结果单放、单烧和复合伤24 h大鼠血清刺激后的IEC-6细胞Akt磷酸化水平较正常大鼠血清刺激的高,其中烧伤组最高。单放组血清与单烧血清比较有11个差异峰,复合伤组与单烧组相比有6个差异峰。结论单放、单烧和复合伤血清均可有效激活IEC-6细胞的PI3K/Akt通路,烧伤组最强,可能和烧伤组血清特殊变化有关。

由EST到全长cDNA——RACE及相关技术进展

由EST出发获得全长cDNA是基因组和功能基因组研究的重要内容之一,cDNA末端快速扩增技术(RACE)是实现此目的的重要方法。本文对RACE的基本原理及其改进,尤其是AM-MV酶TS(template switch)功能的应用带来的技术革新进行了综述。

大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的 克隆和鉴定大剂量辐射前后大鼠空肠上皮细胞IEC 6差异表达基因 ,为探索肠上皮细胞辐射损伤修复的分子机制提供线索。方法 IEC 6细胞经 3 5Gyγ射线照射后由抑制性消减杂交 (SSH)方法和T/A克隆技术进行差异表达基因消减cDNA文库的构建 ,用反向Northern杂交法对库中的EST序列进行筛选 ,挑取阳性克隆测序 ,和GenBank比对后挑选有限克隆进行正向Northern杂交进行验证。结果 扩增消减杂交cDNA文库得到约 2 0 0 0个克隆 ,随机选取 96个白色克隆进行PCR扩增 ,用反向Northern杂交法对库中的EST片段进行筛选得到 15个阳性克隆 ,代表 12个基因的转录产物 ,部分基因功能已经明确 ,涉及细胞骨架、细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面 ,另外还获得一新的cDNA序列。结论 SSH法建立了IEC 6细胞差异表达基因消减cDNA文库 ,一次获得多条差异显示EST片段 ,基因种类涉及细胞骨架 ,细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面 。

依托研究生构建分子生物学实验室技术平台的尝试

探讨了依托研究生对研究平台的建立、维护、传承等几个方面内容,旨在提高实验室运行效率,整合有限研究资源,促进研究生成才,达到双赢的管理局面。

重庆市医学放射工作人员岗前基础知识培训的实践和体会

放射卫生基础知识的掌握对理解放射防护相关的制度、法规、标准等至关重要,但往往得不到受训人员和相关单位的重视。通过问卷调查,了解了重庆市放射诊疗工作人员岗前培训的基本现状,并根据实际情况确定了适合短时间集中培训的放射卫生学基础知识的学习内容,再联系实际进行适度的PBL课堂教学设计,收到了良好效果,为今后开展放射诊疗工作人员培训和放射卫生知识宣传提供了科学依据和相关经验。

听教学示范课的体会

听教学示范课是青年教师提高教学技能的重要手段。听课之前需有准备、有目的,听课时需关注示范教师的课堂教学环节、教学艺术和课堂教学组织,听课后需根据自身情况做好总结与分析。

新基因RS1在辐射损伤小鼠的组织表达谱研究

目的 探讨新基因RS1在辐射损伤小鼠的组织表达谱情况 ,为RS1的克隆和功能研究提供更多的线索。方法 利用半定量RT PCR的方法研究RS1在辐射损伤小鼠肠上皮、肝、肾、脾脏的表达情况 ,利用原位杂交的方法观察RS1在辐射损伤小鼠肝、肾、脾脏和心肌的表达情况。结果 RS1在辐射损伤小鼠除在肠上皮表达以外 ,在肾、肝、脾等多处表达 ,其中脾脏和肾脏的表达较高。结论 RS1具有广泛的组织表达谱。可以利用肾脏和肝脏来源的 。

退运铅酸蓄电池性能及修复技术研究

利用内阻测试仪、充放电测试仪对退运铅酸蓄电池性能特性进行了分析;综合电解液补充-充放电循环-脉冲修复等手段对退运铅酸蓄电池进行修复。研究结果表明,运行10年变电站用铅酸蓄电池性能劣化严重,电池内部正负极板栅基本腐蚀断裂,内阻显著增大,无法修复;运行6年的蓄电池外观状态良好,内阻增大,内部栅筋出现腐蚀,经过修复容量可提升10%,修复意义不大;运行3年的蓄电池内阻增加不明显,经过修复后容量可以恢复到80%以上。

动力锂电池性能衰减过程内部结构分析研究

以电动汽车退役动力锂离子电池(退役电池)、报废动力锂离子电池(报废电池)为研究对象,利用扫描电镜(SEM)、X射线能谱仪(EDS)、X射线衍射仪(XRD)、电化学充放电仪、内阻测试仪、气相色谱仪等仪器研究电池外特性衰退过程电极表面形貌及活性物质材料的理化特性,研究引起动力锂离子电池性能衰减的原因。研究结果表明:电极活性物质和导电剂的溶解与脱落,电极材料粒径尺寸和形貌变化,以及负极表面SEI膜重复再生是导致动力锂离子电池性能衰减的主要原因。此外,上述情况的发生导致电池内部不断产生气体,电池内阻增大,电极极化加剧。

重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染

目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。

γ射线照射前后IEC-6细胞蛋白质组的差异分析

目的 分析γ射线照射后肠上皮细胞系 (IEC 6)细胞蛋白质组的改变。方法 分别提取正常IEC 6细胞和经过 2 5Gy照射后细胞的蛋白样品 ,采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术进行分离 ,考马斯亮蓝染色后经PDQuest软件分析双向电泳图谱 ,对部分差异的蛋白点进行胶内酶切、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)测定其肽质量指纹图谱 ,在网上检索数据库鉴定差异蛋白 ,并采用RT PCR间接证实其变化。结果 获得了较好的双向电泳图谱。图像分析显示 :在正常IEC 6细胞中检测到 ( 60 8± 3 9)个蛋白质点 ,细胞照射后的样品中检测到 ( 5 95± 3 1)个蛋白质点 ,其中匹配的蛋白点为 3 96个。对表达差异的 16个蛋白质点进行肽质量指纹图谱分析 ,经数据库检索后初步鉴定为一些与代谢、自由基清除、细胞骨架相关的蛋白。RT PCR证实了ERP2 9基因在照射后增强。结论 电离辐射可以诱导IEC 6细胞蛋白质组发生改变。

PDGF-A基因逆转录病毒载体的构建及其在猪骨髓间充质干细胞中表达的研究

目的克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础。方法采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs。采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性。结果经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致。成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性。结论成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达。bMSCs转染PDGF-A后仍具干细胞特性。

异体骨髓间充质干细胞在骨髓嵌合小鼠体内分化为肝细胞的实验研究

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性。方法雌性C57BL/6J小鼠全身一次性接受10Gy60Coγ射线照射后立即接受同品系绿色荧光蛋白(green fluores-cence protein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植。移植后1周、1、3个月取骨髓嵌合小鼠肝脏,石蜡切片行GFP抗体免疫组化,冰冻切片在荧光显微镜下观察GFP阳性细胞在肝内分布。石蜡切片行GFP抗体和白蛋白(albumin,Alb)抗体以及GFP抗体和细胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)抗体免疫荧光双标染色法,以此检测GFP阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况。结果移植后1周、1、3个月骨髓嵌合小鼠肝内皆可见GFP阳性细胞,且有随时间减少的趋势,并都可见GFP和Alb双阳性细胞。结论异体骨髓间充质干细胞可在骨髓嵌合小鼠体内分化为表达Alb和CK18的肝细胞,为肝组织的再生和修复提供了新思路。

供体骨髓来源干细胞在骨髓嵌合小鼠肠上皮中定植和分化研究

目的观察骨髓移植后供体骨髓来源干细胞(bone marrowderived stem cells,BMDSCs)是否能够在受体肠上皮中定植并分化为肠上皮细胞。方法使用密度为1.073 g/mL的Percoll分离GFP转基因小鼠的骨髓有核细胞。利用60Co放射源对C57BL/6小鼠进行10 Gy致死剂量照射,照射后4 h经尾静脉移植绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠骨髓细胞建立嵌合小鼠模型,移植后1月和6月取小肠标本石蜡包埋。使用GFP抗体鉴定GFP阳性供体细胞在小肠上皮的表达情况,并使用GFP抗体和细胞角蛋白(PCK)抗体进行双标以判断BMDSCs是否分化上皮细胞,同时结合绒毛蛋白(Villin)和GFP的免疫荧光双标及连续切片染色肠道特异转录因子CDX2和GFP来分析骨髓来源细胞是否分化为肠道功能性上皮细胞。结果供体骨髓来源细胞在嵌合鼠的骨髓和小肠上皮层中均有定植,且小肠上皮中GFP阳性细胞能够同时表达PCK、Villin和CDX2。结论供体骨髓来源干细胞可以在骨髓嵌合小鼠的肠上皮定植,并分化为具有正常功能的小肠上皮细胞。

电离辐射诱导小鼠小肠隐窝和绒毛的基因表达分析

目的通过基因表达的芯片分析方法,观察电离辐射引起的小鼠小肠上皮隐窝和绒毛基因表达的改变,探讨隐窝细胞的DNA损伤和修复、细胞周期调控的特点。方法 20只5周龄C57/BL6小鼠雄性20～22 g,随机分组,对照组不经电离辐照,处理组经12 Gy电离辐射全身照射后,于4、8、24 h分离小肠隐窝和绒毛上皮细胞,用cDNA表达谱芯片分别检测隐窝和绒毛基因表达的动态变化,对上调或下调的基因进行聚类分析,并重点对DNA损伤修复相关和细胞周期相关基因进行分析。结果与对照组相比上调或下调2倍以上的基因(P<0.01)经聚类分析被归属为各细胞信号通路,其中主要涉及p53通路、MAPK通路、凋亡、细胞周期以及免疫反应(P<0.05),将P值排序发现p53通路、MAPK通路对隐窝的调控更为明显。各DNA修复途径代表基因在隐窝和绒毛中均有不同程度的上调表达,且与细胞周期的变化相一致。基因表达特点提示隐窝细胞以准确性高的方式(核苷酸外切修复、同源重组)进行DNA损伤修复,而绒毛细胞则以快速但易发生错误修复的方式(错配修复)恢复基因的完整性。结论 电离辐射诱导的DNA损伤反应与细胞分化程度相关,隐窝细胞对损伤更敏感。

骨髓移植后受体小鼠肠上皮内供体细胞的免疫电镜观察

目的探讨骨髓移植后供体骨髓来源干细胞(bone marrow derived stem cells,BMDSCs)是否能够在受体肠上皮分化为具有正常超微结构和功能的肠上皮细胞。方法使用Percoll液分离GFP转基因小鼠骨髓有核细胞,经尾静脉移植后3个月取材。标本经戊二醛固定,饿酸后固定,常规电镜超薄切片。采用包埋后染色免疫电镜技术以GFP抗体识别供体细胞,5nm胶体金标记二抗识别一抗后,进行电镜染色和观察。结果透射电镜下可见电子密度高的单个或成簇分布的球形胶体金颗粒散布于肠上皮细胞内,阴性对照组未见胶体金颗粒。阳性细胞主要为杯状细胞和吸收细胞,且阳性细胞同其他上皮细胞之间存在有细胞连接。结论通过免疫电镜技术证实,移植后的供体骨髓来源细胞可以在受体小肠组织中分化为具有正常功能的肠上皮细胞。

研究生助教参加防原医学实验教学的实践与思考

实验教学是防原医学教学的重要组成部分，加强实验教学有利于培养学员实际操作能力、综合分析能力和创新性思维能力。当前研究生担任实验助教在高校正逐步开展，但存在很多问题。从研究生的角度，对实验教学设立研究生助教的作用和意义，存在的问题及对策作初步探讨。

真皮多功能干细胞尾静脉输注后在放创复合伤大鼠体内分布的定量分析及其促愈作用

目的:定量分析尾静脉输注的真皮多功能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSC)在放创复合伤大鼠体内的分布,并观测其对创面愈合的作用。方法:体外分离培养大鼠 dMSC 并用~3H-TdR 标记,经尾静脉注射入大鼠体内后,液闪法测量各组织器官内细胞的分布;同时观察其对创面愈合的作用。结果:伤后1周始,复合伤组创面和骨髓 dMSC 含量明显高于正常对照组(P<0.01),而肺脏、肝脏等组织器官 dMSC 含量在两组之间无明显差异(P>0.05);伤后3周和4周,复合伤组大鼠创面和骨髓单位重量组织 dMSC 含量明显高于肺脏、肝脏等组织。细胞输注组创面残留面积从伤后15d 开始明显小于无细胞输注组(P<0.05)。结论:静脉输注的dMSC 可偏向性分布于损伤较重的皮肤创面和骨髓,并可明显地促进创面愈合。

3D培养体系中不同肠上皮细胞株形成肠类器官潜能的比较及应用

目的比较不同肠上皮细胞株在3D培养条件下形成肠类器官的潜能及特点,为利用肠上皮细胞株培养肠类器官提供实验研究基础。方法使用IEC-6、CT26.WT、Caco-2三种肠上皮细胞株进行3D培养,分析不同细胞株形成肠类器官的潜能。流式分选获取Caco-2单细胞后使用Matrigel进行培养并测定其生长速度。比较2D和3D培养条件下Caco-2细胞中肠道干细胞标志物Lgr5、Olfm4及增殖标志物Ki67的mRNA表达差异。免疫荧光染色分析2D和3D培养时Caco-2细胞内Ki67阳性细胞及lamp1阳性溶酶体的分布特点。比较5 Gy和15 Gy照射后Caco-2来源肠类器官中TUNEL阳性细胞分布特点。结果 3D培养时,Caco-2细胞可形成肠类器官,而IEC-6和CT26.WT细胞不能形成肠类器官,且单个Caco-2细胞也可形成肠类器官。Caco-2来源肠类器官中肠道干细胞标志物Lgr5、Olfm4和细胞增殖标志物Ki67的mRNA表达水平较2D培养时显著降低(P<0.05),Ki67阳性增殖细胞较2D培养显著减少。Caco-2来源肠类器官中细胞内溶酶体呈极性分布,与小肠组织切片中溶酶体在肠上皮细胞内的分布一致。电离辐射可引起Caco-2来源肠类器官内细胞发生凋亡,且凋亡细胞比例与照射剂量密切相关。结论 Caco-2在3D培养时可形成与在体肠道结构和功能类似的肠类器官,为下一步进行胃肠道电离辐射研究和药物评价研究提供了更加稳定可靠的体外研究模型。

Lewis肺腺癌对小鼠肠道干细胞及其微环境的影响

目的探讨Lewis肺腺癌(Lewis lung cancer,LLC)对小鼠肠道干细胞及其微环境的影响。方法比较不同接种方式(皮下接种和静脉移植)在C57BL/6J小鼠肺部形成肺腺癌的能力差异。通过HE、BrdU免疫染色和qPCR检测LLC对肠道形态、增殖动力学、肠道干细胞及其微环境相关基因、肠上皮细胞紧密连接及炎症因子表达的影响。使用EdU染色评价LLC条件培养基(LLC-CM)对IEC-6细胞增殖的影响。使用LLC细胞和LLC-CM观察肺腺癌对肠类器官生长的影响。结果静脉移植LLC细胞较皮下接种荷瘤更易在小鼠肺部形成肺腺癌。肺腺癌导致绒毛和隐窝长度较对照组显著增加(P<0.01),BrdU阳性细胞数量和Ki67基因mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。LLC-CM可增加EdU阳性IEC-6细胞数量(P<0.05)。肺腺癌小鼠肠组织中肠道干细胞标志物基因(Lgr5、Olfm4、Axin2)表达水平显著下降,微环境相关基因(Wnt3)表达水平降低(P<0.05)。肺腺癌引起肠上皮ZO-1免疫染色以及ZO-1和OCLN mRNA表达显著降低,IL-1β和TNF-α的mRNA含量显著增加(P<0.05)。LLC细胞和LLC-CM均抑制肠类器官生长。结论Lewis肺腺癌能够破坏肠道干细胞及其微环境,为肺癌与肠道交互作用提供了新的实验依据。