CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。

香蕉EST-SSRs标记的开发与应用

从NCBI搜索的2282条香蕉EST中，发掘出含有SSR的EST序列110条，共有122个SSR位点，检出率为5.3％。SSR位点可分为37种重复单元，平均长度为20bp，其中二、三核苷酸重复单元的SSR占主导地位，分别占总SSR的33．1％和47．6％。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型，分别占二、三核苷酸重复类型的75．7％和36．0％；其他重复类型所占比例均不足10％，而四核苷酸重复类型最少，为4．0％。设计的63对EST-SSRs引物中，有41对EST-SSRs引物对巴西蕉基因组DNA能扩增出产物，占总引物数的65．1％。应用进一步筛选出的重复性好、多态性高的19对引物对49个香蕉品种（系）进行PCR扩增。每对51物扩增的多态性带数目为4～12个，平均7．58个；引物多态信息量变化范围为0．3572．0．8744，平均0．7324。在相似系数为0．63的水平可将49个品种聚为2个类群：一类为含B基因组香蕉品种；另一类为不合B基因组的香蕉品种，表明EST-SSR引物可以应用于香蕉品种资源分类的研究。

部分香蕉品种SSR指纹图谱的构建

采用SSR标记技术构建香蕉品种的分子指纹图谱,为香蕉品种鉴定提供依据。以56份香蕉种质为材料,从199对引物中筛选出5对多态性及稳定性较高的SSR引物进行PCR扩增。5对引物在56个品种中扩增出的多态性带数在11～16个,平均为13.8条;引物的多态信息含量(PIC)在0.8490～0.9022,平均0.8727。依据香蕉SSR带型特征,对每个引物生成的不同带型直接编号,简化香蕉SSR带型记录方法,并利用每个品种的带型编号,建立其DNA分子指纹图谱,5对引物可将56份供试香蕉材料完全区分开。表明SSR标记技术可用以鉴定香蕉种质。

广西主要杧果资源遗传关系的SSR分析

应用SSR技术,对48个杧果品种(系)的遗传关系进行了检测。14个SSR基因座在48个品种(系)中分别扩增出3～6个等位基因,共获得63个等位基因,等位基因数(A)平均为4.50;有效等位基因数(Ne)平均为2.66,各基因座的多态信息含量(PIC)值在0.1929～0.6863之间,平均0.5337,平均杂合度观测值(Ho)和期望值(He)分别为0.4241和0.5943。品种间的遗传相似系数在0.4559～0.9412之间,平均为0.7053,以桂热杧06-3号与桂热杧06-5号两者之间的相似系数最小,而Keitt与红凯特杧及玉文杧与蜜桃杧之间相似系数最大。UPGMA聚类分析将48个品种分为5大类群。聚类结果表明,在分子水平上,杧果品种间的亲缘关系与胚性无直接关系;且广西本地杧果品种(系)多是象牙杧、青皮杧、吕宋杧或秋杧等的杂交子代或实生后代。

脉冲电镀制备钛基二氧化铅电极

应用脉冲电镀技术制备钛基二氧化铅电极,考察了制备电极在1 mol/L的硫酸溶液中的电化学特性. 对制备电极进行SEM研究,测定了电极的电化学动力学参数,并与直流电镀制备的电极进行了比较. 结果表明,脉冲电镀电沉积可以降低晶粒大小,改善镀层的物理性能,增高电极的析氧电位.

香蕉品种(系)遗传多样性的SSR分析

[目的]从分子水平上研究香蕉种质资源的遗传多样性和亲缘关系,建立分子水平香蕉分类系统。[方法]应用SSR技术从分子水平上对32个香蕉品种(系)的遗传关系进行检测。[结果]39对SSR引物在32个品种(系)中扩增带数在4～20个,平均每个SSR座位可检测2.78个多态性带,引物的多态信息量(PIC)在0.45～0.91,平均0.80。依据SSR数据计算的品种间遗传距离在3.06%～43.61%,平均30.73%。[结论]香蕉品种之间存在较为丰富的遗传变异。

香蕉不同器官中microRNA差异表达分析

【目的】研究mi RNA在香蕉不同器官中的表达,初步探索mi RNA在香蕉生长发育过程中的可能作用。【方法】利用茎环引物的半定量和实时荧光定量PCR策略,检测香蕉中的保守mi RNA,并进一步研究mi RNA在香蕉根系、叶片、雄花和果实组织中的表达差异。【结果】mi RNA156d和mi RNA162a具有相似的表达模式,其最高表达量均出现在雄花组织中。mi R156d在雄花中的表达量(2.25)明显高于根系(0.17)、果实(0.34)和叶片(1.00);mi R162a在雄花中的表达量最高,为4.36,根系组织次之,为1.72,而在叶(1.00)和果实(0.99)中的表达几乎相同。mi R164e在根系中的表达量最高,为2.37,雄花次之,为1.93,而在叶(1.00)和果实(0.98)中表达几乎相同。mi R169h在4种组织中的表达量差异不明显。【结论】以香蕉各组织总RNA为模板,通过以SYBR Green为染料的Stem-loop q RT-PCR方法,成功地在香蕉根系、叶片、雄花和果实4种器官中均检测到了保守mi RNA的表达,表明本研究所建立的体系是定性或定量检测香蕉植株中保守mi RNA的准确而有效的方法。同时,在香蕉的不同组织中发现了具有显著表达差异的mi RNA,符合mi RNA在不同组织的表达活性具有多样性的规律。

番木瓜果皮和种子总RNA提取方法的研究

CTAB法、SDS法和改良的热硼酸法所提取的番木瓜果皮总RNA产量分别是107.8、90.4和70.4μg/g;种子总RNA产量分别是164.0、204.8和111.2μg/g。用TSSE或TE溶液溶解CTAB法中的LiCl过夜沉淀,得到的总RNA完整性好、纯度高,种子总RNA的产量明显提高,达到300μg/g以上。用CTAB法提取的果皮和种子总RNA已成功用于cDNA合成、文库构建和抑制消减杂交(SSH)等后续分子生物学试验。

香蕉根系转录组SSR位点信息分析

旨在为开发新的香蕉功能基因相关的且多态性良好的SSR标记提供依据。利用MISA工具对香蕉根系转录组unigene序列进行SSR检索,并设计SSR引物,分析香蕉根系转录组中的SSR位点信息。从25158条unigene中共发现4663个SSR,分布在3820条unigene序列中,出现频率为18.53%,平均每7.77 kb含有1个SSR位点,共有58种重复基元。香蕉根系转录组中,二、三核苷酸重复基元所占比例最大,分别为40.50%和40.63%;二者分别以AG/CT和AGG/CCT重复基元为主,分别占该重复基元的88.03%和30.83%。SSR重复次数以5~9次为主,基序长度主要分布于12~20 bp,平均长度为18.80 bp。香蕉根系转录组SSR位点频率、密度较高,类型多样,在香蕉遗传多样性研究及分子标记辅助育种中有较大应用潜能。

香蕉冷胁迫相关MicroRNA差异表达分析

研究香蕉miRNA在冷胁迫处理下的动态表达,初步探索miRNA在香蕉冷胁迫过程中的可能作用。利用茎环引物实时荧光RT-PCR(stem-loop qRT-PCR)策略,检测冷胁迫响应miRNA在5℃冷胁迫处理不同时间点香蕉幼苗叶片中的表达模式。结果表明,在检测的15个香蕉miRNAs中,不同的miRNA在同一冷胁迫时间下的表达量存在很大差异。根据其表达模式,可将15个miRNA分成4组。组1和组2中的12个miRNA(miR159e、miR159f、miR160-3p、miR397a、miR399j、miR164e、miR444a、miR408、miR5179、miR530、miR535和miR5538),在5℃冷胁迫处理下表达量总体为上调,其在胁迫过程中的平均表达水平高于对照CK(0 h),说明冷胁迫诱导此类miRNA的表达。第3组包括miR156l、miR162a和miR166a,其在5℃冷胁迫处理各时间点的表达量均低于对照,为下调表达,说明冷胁迫抑制此类miRNA的表达。第4组仅含1个miRNA,即miR156a,除在冷胁迫处理12 h表达量明显上调外,其余时间点均下调表达。对这些miRNAs作用的靶基因进行预测和分析发现,它们主要参与植物的新陈代谢、信号传导和生长发育过程等。这为进一步验证与低温胁迫相关的目的miRNA的功能提供理论依据。

猕猴桃果实特异表达异戊烯基转移酶基因植物表达载体的构建

以pBI121质粒为载体,将猕猴桃素基因启动子与ipt编码基因连接,构建猕猴桃果实特异表达ipt嵌合基因。

一种简便有效的香蕉小分子RNA提取方法

【目的】提供一种简单、经济、高效的香蕉小分子RNA提取方法,以满足RT-PCR、Northern杂交等分子生物学研究的需要。【方法】以巴西蕉(Musa acuminata L.AAA group,‘Brazilian’)的叶片、雄花、果实和根系为材料,利用改良的CTAB法,结合使用PEG8000分级沉淀DNA和大分子RNA,从而获得小分子RNA。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示小RNA带型清晰,无DNA和大分子RNA干扰,说明小RNA质量较好。获得的小RNA经紫外光谱分析其A260/A280的比值在1.872~2.020,产量可达35μg·g-1。以提取的各组织小分子RNA为模板,利用茎环RT-PCR方法在香蕉不同组织小RNA中均检测到mi RNA156a,其扩增片断大小约为70 bp,且测序结果与预测的香蕉mi R156a序列一致。【结论】本实验提供了一种简便高效的香蕉小分子RNA提取方法,可满足RT-PCR、Northern blotting及小RNA文库构建等后续分子生物学研究的需要,为研究人员在实际工作中提供了更多的选择。

香蕉抗寒研究进展

香蕉是热带亚热带植物,低温是影响其生长及产量的重要环境因子,温度低于15℃就会抑制香蕉的正常生长。因此,研究香蕉品种的抗寒性具有重要的价值及意义。本文对国内外香蕉抗寒的生理生化、分子生物学及育种方面的研究进行了总结,旨在为培育香蕉抗寒新种质提供参考。

射频消融左侧旁道治疗室上性心动过速

射频消融左侧旁道治疗室上性心动过速北京医科大学人民医院心内科王静毅，郭继鸿，吴益明，朱继红，王伟民，赵红，刘喜荣射频消融术是目前根治阵发性室上性心动过速（ＰＳＶＴ）安全而有效的方法之一，我院自１９９１年１０月至１９９３年３月用本法共治疗９４例ＰＳＶＴ...

芭蕉属rDNA的ITS序列分析

为了研究芭蕉属ITS序列的变异情况和组群关联,以不同地理来源的33份芭蕉属野生种作为试材,对其ITS区进行扩增、测序和序列比对,构建NJ系统树。结果表明:芭蕉属中不同类型材料的ITS序列信息位点为108个,占总碱基数的24.43%,具有较强的系统发育信号;组群间序列比对结果分析发现澳蕉组ITS序列与其他组别相比具有非常显著的差异,特异性片段共21处;从序列上推断澳蕉组可能由M.schizocarpa与M.balbisiana(ITC0271)杂交产生;真蕉组和观赏蕉组没有确切的分类特性;ITS序列的分化上可能受到地理分布的影响;陈友鉴定的新种M.tongbiguanensi在ITS序列上与其他种可明显区分开,从分子水平上验证了新种的可能性。利用核糖体ITS序列对进一步深入研究芭蕉属植物遗传演化关系具有一定的指导意义。

多普勒超声心动图对主动脉夹层诊断的评价

本文报道了5例主动脉夹层的多普勒超声心动图的阳性所见,其中4例为DeBakey Ⅲ型,1例为Ⅰ型。其阳性所见;(1)4例降主动脉增宽,1例升主动脉增宽;(2)与脉搏同步的摆动性内膜瓣在腹主动脉内最清楚见到,并在收缩期有红色血流填充;(3)2例在主动脉弓远端可见撕裂口;(4)降主动脉双腔形成,真腔内有彩色血流填充,假腔内则无。以上阳性所见对诊断本病起重要作用。

GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂.

香蕉A基因组品种间遗传关系的SSR检测

应用SSR技术,对32个香蕉A基因组类型品种(系)的遗传关系进行了检测。40对SSR引物在32个品种(系)中分别扩增带数在3～15个,平均每个SSR座位可检测2.99个多态性带;引物的多态信息量(PIC)在0.00～0.88,平均0.62。依据SSR数据计算的品种间遗传距离在0.00%～34.27%,平均12.45%,大多数品种间的遗传变异非常有限,但也存在着遗传差异突出的品种:FHIA25、Yangambi KM5、Pisang Jari Buaya、Rose和皇帝蕉。依据26%的遗传距离,除了FHIA25和Pisang Jari Buaya单独化成1组外,其它30个品种可以分为2组:品种间遗传差异相对较高的组I和品种间遗传差异相对较低的组Ⅱ。Williams与引进的洪都拉斯3号、M931之间,洪都拉斯1号和洪都拉斯2号之间,高脚青芽蕉和高脚顿地雷分别没有区分开来,这可能是同物异名,也可能是同一品种未能分辨的突变体。

棉花SSR分子标记在香蕉中通用性的研究

香蕉栽培品种是由尖叶蕉(Musa acuminata Colla,记为A基因组)和长梗蕉(Musa bilbisiana Colla,记为B基因组)这两个原始野生蕉种内或种间杂交后代进化而成的。目前,香蕉SSR分子标记开发的数量和应用研究非常有限,需要开展其它物种SSR分子标记在香蕉中的通用性研究。棉花(Gossypium spp.)是重要的经济作物,已经从基因组和EST开发了大量SSR分子标记。本研究应用1595对棉花SSR引物首先对A基因组的代表品种贡蕉和B基因组的代表品种野蕉进行转移扩增,得到183对有效扩增的引物。然后以20个香蕉栽培品种和4个野蕉品种对183对有效扩增的引物进行多态性筛选,最后得到111对多态性引物,共扩增到797个等位基因,平均每对引物的等位基因数为7.2。引物多态信息含量(PIC)在0.61～0.91之间。应用非加权类平均聚类方法,在相似系数0.61处将24个品种分为两大类群,类群I是以A基因组为主的品种群,类群Ⅱ是以B基因组和A基因组与B基因组杂交的品种群。

棉花EST-SSRs在香蕉中的通用性

香蕉SSR分子标记开发和应用有限,通过对棉花SSR分子标记在香蕉中的通用性研究。用1343对棉花EST-SSR引物对贡蕉(AA)和野蕉(BB)两个材料进行转移扩增,得到226对有效扩增的引物。进一步用该226对引物对20个香蕉品种和4个野蕉材料扩增,得到了157对多态性引物。157对多态性引物共扩增到1188个条带,平均7.6个;引物的多态信息含量范围在0.58～0.91之间。依据获得的SSR数据,应用非加权类平均聚类方法,在相似系数0.60水平上,将24个品种分为两大类群,类群I是以A基因组为主的品种群,类群Ⅱ是以B基因组和A基因组与B基因组杂交的品种群,证明了棉花EST-SSR分子标记在香蕉中具有通用性。