一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个新的金属硫蛋白基因LbMT2全长cDNA序列。该基因全长518bp,其中5′非翻译区(UTR)64bp,3′非翻译区205bp,开放阅读框(ORF)249bp,编码由82个氨基酸组成的蛋白质,编码蛋白的分子量为8.1kDa,理论等电点(pI)为4.72。利用实时定量PCR方法研究了二色补血草在CuSO4、CdCl2、NaCl、低温和PEG胁迫下不同时间该基因的表达模式。结果表明,CuSO4、CdCl2、NaCl和低温处理均能诱导LbMT2基因在二色补血草的根和叶中的表达,而PEG处理则抑制了LbMT2在根和叶中的表达。构建LbMT2基因的原核表达载体pGEX-LbMT2,通过IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中融合表达,SDS-PAGE电泳获得35kDa的蛋白条带,大小与预期相符。

ABR启动期运行效能及互营产甲烷菌群的分布特征

为探讨厌氧折流板反应器(ABR)启动期运行效能和互营产甲烷菌群的空间分布特征,考察了ABR反应器处理制糖废水启动期的运行特征,并采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析了互营产甲烷菌群在ABR各格室的分布规律.结果表明,在污泥驯化阶段,ABR的COD去除率为61.5%,出水挥发酸总量高达1808mg/L.经过2个阶段的调控运行后,ABR出水挥发酸明显降低,甲烷含量增加至55%以上,COD去除率达到了94.8%.而且ABR第2～4格室形成了沉降性能良好的颗粒污泥.PCR-DGGE检测结果表明,该ABR系统中的主要产氢产乙酸菌为Syntrophobacter和Pelotomaculum,主要分布在ABR系统第3,4格室.ABR第1,2格室的产甲烷菌主要为耐酸的氢营养型产甲烷菌(Methanoregula和Methanosphaerula),而乙酸营养型产甲烷菌(Methanosaeta和Methanothrix)主要分布在第3,4格室.ABR系统中产甲烷菌的多样性要明显高于产氢产乙酸菌,说明当系统受到冲击时,产氢产乙酸作用比产甲烷作用更易成为限速步骤.

紫杆柽柳MnSOD基因在非生物胁迫中的作用

构建了酵母表达载体pYES2-MnSOD,并将其转入酿酒酵母INVSc1,以转空载体pYES2的酵母INVSc1为对照,检测其抗NaCl、Na_2CO_3、NaHCO_3和紫外线胁迫能力。结果表明,转MnSOD基因酵母在以上逆境因素胁迫下的存活率有明显提高,说明MnSOD基因具有较强的抗NaCl、Na_2CO_3、NaHCO_3和紫外线胁迫能力。

HRT对UASB运行效能及丙酸氧化菌群组成的影响

丙酸氧化菌群可将丙酸转化为产甲烷菌可利用的乙酸和H2/CO2,在厌氧产甲烷系统中占据独特的生态位,了解其在厌氧废水处理系统中的变化规律,对于系统的调控运行具有重要意义。考察了中温条件下水力停留时间(HRT)对升流式厌氧污泥床反应器(UASB)的运行效能及丙酸氧化菌群更迭的影响。结果表明,在进水COD为1000mg.L-1条件下,HRT在一定范围内的缩短会对UASB系统造成一定的冲击,短时期内出现丙酸和乙酸的积累,但在维持运行一段时间后可重新达到运行的稳定状态,并保持了较高的COD去除率。在HRT 24、20、16、12、8h条件下的稳定阶段,系统的平均COD去除率分别为94.9%、93.9%、92.5%、91.8%和87.9%。HRT的缩短使系统活性污泥中的丙酸氧化菌群发生了更迭,HRT 24h条件下居优势地位的Syntrophobacter pfennigii在HRT 8h条件下消失,取而代之的是S.sulfatireducens,Pelotomaculum和Desul-fotomaculum,而Smithella丙酸氧化菌具有更宽的生态位,在系统中始终占据一定的优势度。在系统中富集更多的丙酸氧化菌群,可有效提升UASB的处理效能和运行稳定性。

萘厌氧降解菌群的富集及氧化还原介体的强化

为揭示氧化还原介体(ROMs)对萘厌氧降解的强化作用,以萘为唯一碳源富集到中温萘厌氧降解菌群.通过Illumina MiSeq测序对接种污泥和富集培养物进行了细菌群落结构解析,并考察了固定化蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)、蒽醌-2-磺酸(AQS)和腐殖酸强化萘厌氧降解的特征. Illumina MiSeq测序结果表明, Pseudomonas、Thauera、和Georgfuchsia是该富集培养物中的优势萘降解菌,其相对丰度分别为52.4%、13.8%和17.6%.在污泥接种量为0.23g/L和萘初始浓度10mg/L条件下,富集菌群9d内对萘的降解率约为64%. ROMs强化试验结果表明, 3种ROMs对萘的厌氧降解均有一定的促进作用.其中, AQDS的强化效果最为显著,当AQDS浓度为0.8mmol/L,培养至第7d时,萘的去除率为92.0%,比同期的对照组高1.2倍.此外,硝酸盐对ROMs强化萘厌氧降解的影响研究结果表明,在NaNO3浓度为0~0.8g/L范围内,萘的降解速率随着硝酸盐浓度增加呈现先增加后降低的趋势.当NaNO3浓度为0.6g/L时,萘的去除率在第6d就达到了91.0%,比对照组提高了15.2%.由此可见,在厌氧条件下添加适量硝酸盐可提高ROMs对萘降解的强化效果.

丙酸质量浓度对丙酸富集培养物降解特性的影响

为阐明丙酸质量浓度对厌氧生物处理系统中丙酸降解特性的影响，研究了不同丙酸质量浓度条件下丙酸富集培养物的降解特性．以丙酸为唯一碳源，通过15代的传代培养富集到一个中温互营丙酸氧化菌群（包括丙酸氧化菌和产甲烷菌）．聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳（PCR—DGGE）指纹分析结果表明，该富集培养物中的丙酸氧化菌为Syntrophobacter，而嗜氢产甲烷菌和嗜乙酸产甲烷菌分别为Methanobacterium和Methanosaeta．在污泥接种量为0．81g／L条件下，当丙酸质量浓度为1000—2000mg／L时，丙酸能够被该富集培养物快速降解；而当丙酸质量浓度为2500—3000mg／L时，丙酸降解和乙酸的转化均受到一定程度的抑制，但随着培养时间的延长，该抑制作用逐步解除．较高的丙酸质量浓度（≥2500mg／L）能够对丙酸氧化菌产生可逆性抑制作用．

荧光定量PCR解析酸性条件下丙酸氧化菌的演替

采用实时荧光定量PCR技术考察了UASB酸性条件下丙酸氧化菌的演替规律.结果表明,至少有3种已鉴定的丙酸氧化菌(Pelotomaculum schinkii,P.propionicum和Smithella propionica)存在于UASB反应器中.在p H值为7.5~7.1时,P.schinkii是主要的丙酸氧化菌群,其数量为(5.0~5.8)×10~3 16SrRNA基因拷贝数/ngDNA,约占检测到丙酸氧化菌总数的90.6%以上.pH从7.1降到6.8导致S.propionica数量显著增加,P.schinkii和S.propionica成为优势菌群,其数量占丙酸氧化菌总数的88.9%.在pH6.5条件下,S.propionica(74.8%)成为优势丙酸氧化菌群.当p H￡6.0时,S.propionica和P.propionicum演替为优势丙酸氧化菌,表明这两种丙酸氧化菌具有较强的耐酸性.当p H￡6.0时,丙酸氧化菌总数随pH降低而明显减少,这可能是厌氧反应器在酸性条件下发生丙酸积累的根本原因之一.

HRT对丙酸去除效能的影响及丙酸氧化菌群的响应

为探究水力停留时间(HRT)对丙酸去除效能的影响及丙酸氧化菌群的响应,以丙酸为底物,升流式厌氧污泥床(UASB)的运行为基础,研究HRT缩短对UASB系统丙酸去除的影响,并通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)指纹分析技术,分析丙酸氧化菌群随HRT缩短的演替规律.结果表明,在保持进水COD 2 000 mg.L-1不变,HRT由10 h经由8、6 h缩短至4 h的过程中,每次HRT的缩短都会造成UASB系统中丙酸的短期积累.但经过一段时间的连续运行之后,UASB均能重新达到稳定运行状态,并保持较高的丙酸去除率.在此过程中,UASB中厌氧活性污泥的比CODpro去除率由HRT 10 h时的1.2 kg/(kg.d)逐渐提高到4 h时的1.7 kg/(kg.d).HRT的缩短使UASB系统中丙酸氧化菌群发生了明显的演替,以条带2～4为代表的丙酸氧化菌(Syntrophobacter fumaroxidans)随着HRT的缩短逐渐被强化,而条带5(S.sulfatireducens)逐渐减弱.丙酸氧化菌Pelotomaculum propionicicum(条带1和6)在整个运行过程中优势度保持相对稳定.HRT的缩短刺激了具有较高动力学特性的条带2～4(S.fumaroxidans)快速增殖,使其在活性污泥中的优势度不断提高,而该菌的强化使得UASB系统能够在有机负荷高达18 kg/(m3.d)条件下仍保持了94.1%的丙酸去除率.

接种污泥和pH值对CMC-Na厌氧降解的影响及菌群解析

为揭示羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的厌氧降解效率,本研究采用间歇培养方式考察了不同类型接种污泥和初始pH值对其厌氧降解的影响,并通过Illumina MiSeq测序揭示了主要功能微生物对初始pH值的响应特征.结果表明,在CMC-Na初始浓度为5g/L条件下,絮状污泥具有较强的水解、发酵产酸能力.但该系统的产氢产乙酸作用和产甲烷作用较差,导致甲烷产率仅为10.0mL/g CMC-Na.相反,颗粒污泥具有较高的甲烷发酵能力,甲烷产率达到了100.2mL/g CMC-Na.初始pH值对CMC-Na厌氧降解影响试验表明,初始pH 4.5和9.5对甲烷生成表现出明显的抑制作用,而在初始pH 7.5和8.5条件下,甲烷产率达到了最大值(123.4和123.2mL/g CMC-Na).Illumina MiSeq测序结果表明,不同初始pH值环境中的微生物组成存在显著差异.在初始pH 7.5条件下,Methanothrix和Methanobacterium为优势产甲烷菌,而Macellibacteroides,Petrimonas,Trichococcus,Anaerofilum和Brooklawnia为优势产酸发酵菌.当初始pH值为4.5和9.5时,Methanosarcina也成为优势产甲烷菌,且主要产酸发酵菌的相对丰度发生了明显变化.

白腐真菌对PAHs的吸附和降解特征及Tween 80和Cu2+的强化作用

为揭示白腐真菌对多环芳烃(PAHs)的去除特性,采用间歇培养方式考察了白腐真菌对萘、菲、芘的吸附和降解特征,以及Tween80和Cu2+对白腐真菌去除萘、菲、芘的影响。吸附试验结果表明,当萘、菲、芘的初始浓度分别为30.0、1.0、0.1mg L-1时,白腐真菌灭活菌对它们的吸附作用显著高于活菌,其最大吸附率分别为29.3%、38.2%、70.6%。降解试验结果表明,在培养前期,白腐真菌对萘和菲的降解能力很弱,而培养后期降解作用占总去除率的59.6%~77.3%。然而,白腐真菌对芘的累计降解率仅为28.8%。在吸附和降解的共同作用下,萘、菲、芘的去除率最终达到了46.9%、53.5%和73.7%。另外,发现Tween80和Cu2+可以促进白腐真菌对PAHs的去除。当Tween80浓度介于0.1~1.0g L-1时,萘和菲的去除率随Tween80浓度的增加而增加,而芘的去除率随Tween80浓度的增加而呈现先增加后降低的变化趋势。Tween80不仅可以促进白腐真菌的生长,同时能提高漆酶活性。低浓度Cu2(≤+1.25mmol L-1)可以提高白腐真菌的漆酶活性,从而提高萘、菲、芘的去除率,且在Cu2+为0.25mmol L-1条件下的强化作用最为显著,分别比对照(无Cu2+)提高了77.3%、60.9%和23.2%。

pH对UASB运行效能及产甲烷互营菌群的影响

研究产甲烷互营菌群对pH变化的响应,对于寻求提高有机废水厌氧生物处理效能的策略具有重要意义.以处理制糖废水的升流式厌氧污泥床(UASB)反应器的运行为基础,考察不同pH对反应器运行效能及产甲烷互营菌群的影响.结果表明,在进水COD 20 000 mg.L-1、HRT 8 h的条件下,当进水pH分阶段由6.9降至5.4时,UASB系统的pH随之从6.8～7.4下降至5.7～6.7,导致COD去除率降低了23.3%,出水中残留丙酸提高了3.9倍.聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析结果表明,产氢产乙酸菌群在UASB中的多样性显著低于产甲烷菌群,其分布和优势度受pH降低的影响显著.以Eub 19(Pelotomaculum)为代表的食丙酸产氢产乙酸菌在偏酸环境中的优势度明显减弱,而食乙酸产甲烷菌及部分食氢产甲烷菌对pH下降响应并不显著,且随着pH下降,耐酸的食氢产甲烷菌Methanobacterium ferruginis和Uncultured Methanobrevibacter的优势度逐渐增强.由此可见,与产甲烷菌群相比,UASB系统中的产氢产乙酸菌群对pH的变化更加敏感.

UASB反应器中产甲烷菌对温度胁迫的响应

采用间歇培养方式探讨了升流式厌氧污泥床（UASB）反应器中不同营养类型产甲烷菌对温度胁迫的响应规律.研究结果表明,产甲烷螺旋菌（Methanospirillum）是该反应器的主要氢营养型产甲烷菌,而主要乙酸营养型产甲烷菌为产甲烷丝状菌（Methanosaeta）.在35℃条件下,氢营养型和乙酸营养型产甲烷菌的累计甲烷产量分别为24.7,11.7mL,而最大产甲烷速率分别为0.74,0.18m L/h.当温度从35℃分别降低至30,25,20,15℃时,导致氢营养型产甲烷菌的累计产甲烷量分别减少了14.2%,34.0%,47.0%,57.5%,而乙酸营养型产甲烷菌的累计产甲烷量分别减少了5.1%,23.9%,45.3%,95.7%.由此可见,在20～30℃时氢营养型产甲烷菌对温度胁迫更加敏感,而在15℃以下时乙酸营养营养型产甲烷菌对温度胁迫更加敏感.

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138 bp,其中,5′非翻译(UTR)区128 bp,3′非翻译区212 bp,开放阅读框(ORF)全长798 bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28.58 kDa,理论等电点(pI)为9.68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52%,与葡萄Trx序列同源性为76%,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24 h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达.

OLR对UASB运行特性的影响及丙酸氧化菌群的演替

考察有机负荷率(OLR)的提高对升流式厌氧污泥床(UASB)反应器运行特性及丙酸氧化菌群的影响。结果表明,OLR由6 kg COD/(m3·d)逐步提高到54 kg COD/(m3·d)时,UASB的COD去除率可保持在92%以上,厌氧污泥的比产甲烷速率和比COD去除速率分别由130 L CH4/(kg VSS·d)和0.3 kg COD/(kg VSS·d)提高到827 L CH4/(kg VSS·d)和1.8 kg COD/(kg VSS·d)。随着OLR的逐步提高,系统中丙酸氧化菌群发生明显演替,其中,具有较低比生长速率(μ)和最大比降解速率(Umax)的Syntrophobacter wolinii和Pelotomaculum propionicicum被先后淘汰,而具有较高μ、Umax的P.schinkii逐渐成为系统的优势菌,具有较高μ、Umax的丙酸氧化菌的逐步富集可显著提高系统降解丙酸的能力,促进产甲烷菌群的增殖和代谢,使系统的整体处理效能得到显著提升。

qPCR揭示丙酸降解菌群随OLR提高的演替规律

为探讨有机负荷率(OLR)对升流式厌氧污泥床(UASB)反应器运行效能的影响及互营丙酸降解菌群的响应,以稀释的制糖废水为底物,考察了OLR升高对UASB处理效能的影响,并采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析了互营丙酸降解菌群随OLR提高的演替规律.结果表明,在OLR为6.0～54.0kg COD/(m^3·d)的范围内,UASB处理制糖废水取得了良好的效果,其COD去除率为92.0%以上.qPCR检测结果表明,至少有3种已鉴定的丙酸氧化菌(Pelotomaculum schinkii,P.propionicum和Syntrophobacter sulfatireducens)存在于UASB反应器中.其中,S.sulfatireducens是主要的丙酸氧化菌,其数量为126～1.2×10~3 16S rRNA基因拷贝数/ng DNA,约占检测到丙酸氧化菌总数的47.9%～58.6%.OLR从6.0提高至54.0kg COD/(m^3·d)导致所有丙酸氧化菌数量显著减少.Methanospirillum hungatei和Methanosaeta concilii是该UASB系统中的主要氢营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌.与丙酸氧化菌的变化趋势相反,这两种产甲烷菌的数量均随OLR的提高而显著增加,并在OLR54.0kg COD/(m^3·d)条件下达到最大值.

氧化还原介体强化厌氧活性污泥发酵产氢特征

为提高厌氧污泥的发酵产氢能力,采用间歇培养方式考察了氧化还原介体(ROMs)对厌氧污泥发酵葡萄糖产氢效能的影响,并通过Illumina MiSeq测序揭示了ROMs对微生物群落的影响.结果表明,在发酵液体积为100mL及葡萄糖初始浓度500mg/L条件下,对照的累计产氢量和最大产氢速率(R_(max))分别为11.0mL和0.28mL/h.当腐殖酸和蒽醌-2-磺酸钠(AQS)作为ROMs加入发酵体系后,厌氧污泥的产氢能力显著提高,其累计产氢量和R_(max)分别比对照高出56.4%、13.6%和53.6%、10.7%.相反,氧化石墨烯(GO)、指甲花醌和蒽醌-2,6-二磺酸钠(AQDS)导致厌氧污泥的产氢能力受到不同程度的抑制.Illumina MiSeq测序揭示了发酵系统的优势菌群存在显著差异.对照系统中的优势菌群主要来自5个属(Thermomarinilinea、Longilinea、Defluviimonas、Gimesia、Planctomicrobium),腐殖酸、AQS和指甲花醌发酵系统的主要优势菌群为Thermomarinilinea、Longilinea、Ottowia,而Thermomarinilinea、Longilinea、Ottowia、Defluviimonas为AQDS和GO发酵系统的主要菌群.冗余分析的结果表明,产氢量与Longilinea、Macellibacteroides、Trichococcus、Thioflavicoccus和Ottowia呈正相关,而与Defluviimonas、Pirellula、Gimesia和Ignavibacterium呈负相关.

UASB启动运行特征及互营丙酸氧化菌定量分析

为揭示升流式厌氧污泥床(UASB)反应器启动运行效能与互营丙酸降解菌群数量之间的关系,以稀释的玉米淀粉生产废水为底物,考察了UASB启动期的运行特征,并采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析了互营丙酸降解菌群(丙酸氧化菌和产甲烷菌)的演替规律.结果表明,在进水COD 2000mg/L和水力停留时间(HRT)24h条件下,经过38d的连续运行,COD去除率达到了91.9%.当HRT分阶段缩短至8h时,比产甲烷速率达到了315LCH4/(kg COD·d),且形成了沉降性能良好的颗粒污泥.qPCR检测结果表明,至少有5种已鉴定的丙酸氧化菌存在于UASB反应器中.Pelotomaculum propionicum为接种污泥中的主要丙酸氧化菌,约占检测到丙酸氧化菌总数的45.7%.它的数量随着HRT缩短不断减少.而Syntrophobacter sulfatireducens和S.wolinii的数量随着HRT缩短不断增加,并在启动完成时达到最大值,分别为1.3×103,5.5×103个16S rRNA基因拷贝数/ng DNA,演替成为成熟颗粒污泥中的优势丙酸氧化菌群.Methanobacterium和Methanosarcina为接种污泥中的主要氢营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌,其数量随着HRT的缩短而逐渐减少,而Methanospirillum和Methanosaeta的数量随HRT的缩短逐渐增加,成为成熟颗粒污泥中的优势产甲烷菌群.

弱酸性条件下丙酸富集培养物的降解特性

为阐明厌氧生物处理系统中pH降低对丙酸降解的影响,考察了弱酸性条件下丙酸富集培养物的降解特征.在污泥接种量为0.22gMLVSS/L,初始丙酸浓度为1000mg/L条件下,对照组(pH7.0)的丙酸能够被该富集培养物快速降解,在接种第6d时,丙酸去除率达到了98.5%.当pH从7.0分别降低至6.5和6.0时,丙酸降解速度立即下降.但经过2~3d的适应后,丙酸降解速率恢复到对照的水平,并分别在培养至第8d和9d时其去除率达到了97%以上.当pH为5.5时,丙酸降解被完全抑制.在整个实验过程中,均未检测到氢气,而乙酸也只有在培养初期有过短暂的积累.该结果表明,在该丙酸富集培养物中,产甲烷菌对弱酸性环境具有更好的耐受性和适应性.

初始pH对AQS介导剩余污泥暗发酵产氢特性的影响

为探讨pH对蒽醌-2-磺酸钠(AQS)介导剩余污泥暗发酵产氢的影响,本研究采用间歇方式考察了中温条件(35℃)下,初始pH(4.5~7.0)对AQS介导剩余污泥暗发酵产氢效能的影响,并通过Illumina MiSeq测序揭示了暗发酵产氢相关微生物的演替规律.结果表明,在初始pH 4.5~7.0范围内,AQS介导剩余污泥暗发酵产氢效能随pH提高呈先增加后降低再增加的变化趋势.其中,在初始pH 6.0时,剩余污泥的产氢效能最佳,其累计产氢量和最大产氢速率(Rmax)分别为41.9 mL·g^(-1)和16.2 mL·g^(-1)·d^(-1).在该条件下,挥发酸总量也达到最高值590.9 mg·L^(-1),其中乙酸占63.8%.Illumina MiSeq测序揭示了暗发酵系统中优势菌群的丰度存在一定差异,Longilinea、Hyphomicrobium和Pelospora在初始pH 6.0条件下富集,相对丰度分别达到了21.7%、2.6%和1.5%.冗余分析(RDA)表明,氢气产量与Longilinea、Aminivibrio、Guggenheimella、Proteiniclasticum、Pirellula、Youngiibacter、Gimesia和Hyphomicrobium呈正相关性.

氧化还原介体催化强化污染物厌氧降解研究进展

由于厌氧生物处理技术具有产生剩余污泥少、可回收能源等优点而被广泛用于处理各种有机污染物,尤其在有毒、有害、难降解污染物的去除方面取得了良好的效果。然而,厌氧生物法的处理速率通常比较低,而氧化还原介体可通过自身不断的氧化和还原来传递电子,提高电子在氧化还原反应过程中的传递速率,从而促进污染物高效厌氧降解。醌类物质和腐殖酸是应用较多的氧化还原介体,在催化难降解污染物降解方面取得了一定效果。讨论了氧化还原介体的特点、作用机制,并总结了其对偶氮染料厌氧脱色、反硝化和多氯联苯厌氧降解的强化作用,提出了氧化还原介体未来的研究方向。