约氏疟原虫红内期感染小鼠的免疫反应及IL－2、IFN－γ免疫调节作用的研究

在原虫血症上升期，致死株约氏疟原虫（Ｐ，ｙ，）感染鼠脾细胞的增殖反应受到抑制，无γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）产生，血清中未产生特异抗体，仅产生与正常鼠相同的白细胞介素２（ＩＬ－２０）；与此不同，非致死株Ｐ．ｙ．感染鼠脾细胞增殖反应增强，产生ＩＦＮ－γ及更多的ＩＬ－２，血清中还无特异抗体产生。在原虫血症下降期，脾细胞的增殖反应升高，较上升期有更多的ＩＬ－２及ＩＦＮ－γ生成，体内血清中出现滴度较高的特异抗体。免疫鼠脾细胞的增殖反应较前两者明显升高，体内血清特异抗体水平亦明显上升，ＩＬ－２及ＩＦＮ－γ水平与感染鼠原虫下降期相同。表明在Ｐ．ｙ．感染小鼠中，致死株的初次感染可抑制细胞免疫，非致死株在原虫上升期即可出现细胞免疫。原虫下降期细胞免疫功能进一步增强。

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失重组质粒的构建及序列分析

目的：构建ＨＳＶ１ 型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以ｐ ＵＣ１８／ ＴＫ 重组质粒ＤＮＡ 为模板，用ＰＣＲ 方法扩增ＴＫ５′端５０３ｂｐ 基因片段，并将扩增的片段克隆入载体ｐ ＵＣ１８ 中（ｐ ＵＣ１８／ＴＫ１） ；用Ｐｓｔ Ｉ 和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ｐＵＣ１８／ ＴＫ， 获得ＴＫ３′端３８３ｂｐ 片段， 将此酶切片段克隆入ｐＵＣ１８／ ＴＫ１ 中， 并进行测序。结果： 构建成重组质粒ｐＵＣ１８／ ＴＫ－ 。经酶切鉴定获得１ 条约９００ ｂｐ 的基因片段； 序列测定证实， ＨＳＶ１１７ｓｙｎ ＋ ＴＫ 基因缺失了第４９３ ～７４４ 位２５１ 对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的ＨＳＶ１／ＴＫ－ 基因重组质粒，为研制其突变株奠定了基础。

人体寄生虫学课程结构、内容和教学方法改革的研究与实践

以课程之间的交叉融合为主线 ,首先进行人体寄生虫学课程结构改革 ;在此基础上 ,探索与之相适应的教学内容、教学过程和教学方法等改革的途径 ,引导并提高学生的自学能力 ,综合知识、运用知识解决问题的能力和创新精神。

恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

本文采用PCR方法自P .f基因组中扩增了编码AMA 1完整胞外域及其相应结构域的基因片段 ,定向克隆入原核表达载体pET 16b和pET 30a (+) ,经测序确证后将重组子转入BL2 1(DE3)进行诱导表达 ,用SDS PAGE鉴定 ,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化 ,变性蛋白再在GSH GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性。所得纯化产物为进行有关AMA

以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因为基础的复合核酸疫苗诱导小鼠体液免疫反应的研究

目的: 检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 的17 区片段基因为基础的复合核酸疫苗VR1012/TPA/HG-MSP1-17(分泌性)和VR1012/HG-MSP1-17(非分泌性)诱导小鼠的体液免疫反应。方法: 分别用分泌性与非分泌性核酸疫苗肌注免疫小鼠。用间接ELISA法测定小鼠血清的特异性抗体。结果: 每只小鼠经3 次100 μg/100μl非分泌性核酸疫苗免疫后, BALB/c小鼠和C57BL/6 小鼠均产生明显的抗HG和抗真菌表达的MSP1 17 区蛋白(YMSP119 )抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经3 次200 μg/100 μl非分泌性核酸疫苗免疫后, 产生较高的抗HG抗体, 但抗MSP1-17 的抗体无明显变化。经3 次200 μg/100 μl分泌性核酸疫苗免疫后, 只产生较低的抗HG抗体。结论:

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的 为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７），本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因，并纯化及鉴定了表达蛋白。方法 将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １，形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌，纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果 成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７，转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ），纯化后纯度达７２％ ，ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论 成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白，为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７

恶性疟原虫GBP130基因5′近端侧翼序列调控功能的研究(英文)

目的 对GBP130的 5′近端侧翼序列进行分析 ,发现可能的强度和期特异性调控元件。 方法 构建含有不同长度GBP130启动子的质粒载体。用pGBPCATΔ 2、pGBPΔ2 /4 0 0和 pGBPΔ2 /80 0分别转染疟原虫 ,在转染后 48h收集虫体制备细胞抽提物 ,检测报告分子CAT活性 ,分析近端侧翼序列不同区域的强度调控功能。另将 pGBPΔ2 /4 0 0和pGBPΔ2 /80 0分别同时转染疟原虫 ,分别于转染后 5h、15h和 46h收集虫体 ,制备细胞抽提物 ,检测CAT活性 ,分析近端侧翼序列不同区域的期特异性调控功能。 结果 强度分析中 ,当从转录起始点下游删除较小的片段 ( pGBPΔ2 /80 0 ) ,CAT表达水平与pGBPCATΔ 2中CAT水平无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,当删除近端较大片段 ( pGBPΔ2 /4 0 0 )时 ,CAT表达水平明显下降 (P <0 .0 5 )。同时 pGBPΔ2 /4 0 0的转录活性与对照组也有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;期特异性分析 ,pGBPΔ2 /4 0 0与pGBPΔ2 /80 0相比 ,在 5h时前者转录活性高于后者 ,但在 15h和 46h时 ,后者转录活性高于前者 ,提示 2种质粒在疟原虫不同生活阶段具有期特异性调控。 结论 推测不同GBP130启动子活性强度的差异是因为 5′UTR长度的不同 ,较长的UTR可促进基因的转录表达 ,可能GBP130基因近端侧翼序列中 2个同聚

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的 探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法 用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果 重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论 HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 。

通过序列分析筛选单纯疱疹病毒I型蛋白组中的PACS-1结合蛋白

目的筛选单纯疱疹病毒I型蛋白组中的PACS1结合蛋白。方法根据筛选标准,利用ScanProsite和PSORT软件对蛋白质进行分析,并结合相关文献中的实验数据对分析结果进行校正。结果该方法可有效地筛选出PACS1结合蛋白。利用该方法,在单纯疱疹病毒I型蛋白组中,共筛选出可能与PACS1结合的蛋白质33种。结论建立了一种有效的筛选PACS1结合蛋白的方法。筛选出的单纯疱疹病毒I型的PACS1结合蛋白,将为研究PACS1在疱疹病毒发生及潜伏性感染中的作用提供指导。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．

pLTRNL介导HSV-1 TK基因长期稳定转染人肝癌细胞系的建立

以脂质体基因转移技术，将含ＨＳＶ１ＴＫ基因的重组逆转录病毒载体ｐＬＴＲＮＬ转染人肝癌细胞系ｈＨＣＣ。经抗生素Ｇ４１８选择，筛选出ＨＳＶ１ＴＫ基因转染的ｈＨＣＣ，再进行克隆化和亚克隆化后扩大培养。应用ＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ及ｓｌｏｔｂｌｏｔ狭槽印迹等方法，对转染细胞基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ进行了鉴定。结果表明，ＨＳＶ１ＴＫ基因已整合入ｈＨＣＣ细胞基因组中，且有ＴＫ基因的ｍＲＮＡ转录。ＨＳＶ１ＴＫ基因稳定转染的ｈＨＣＣ的建立，为在体外和动物模型上对肝癌进行基因治疗奠定了实验基础。

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因在大肠杆菌中的融合表达

用ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切已构建的含单纯疱疹病毒Ｉ 型胸苷激酶（ ＨＳＶ１ ＴＫ） 基因的ｐ ＵＣ１８／ＴＫ 质粒，将切出的ＴＫ 基因片段克隆入原核表达载体ｐ ＷＲ４５０１ 中，构建成ＨＳＶ１ ＴＫ 基因重组表达质粒ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ。以ＨＳＶ１ ＴＫ 特异性引物ＴＫ１ Ｆｏｒ 和ＴＫ２ Ｒｅｖ 进行ＰＣＲ 鉴定可扩增出预期的５０３ ｂｐ 的ＴＫ 基因编码区部分序列；ＥｃｏＲ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切质粒ｐ ＷＲ４５０１／ ＴＫ， 可切出约１１５０ｂｐ 的ＤＮＡ 片段， 表明重组质粒中已插入ＨＳＶ１ ＴＫ基因片段。用ＩＰＴＧ 诱导ｐ ＷＲ４５０１／ＴＫ／ＪＭ１０９ ，表达出相对分子质量（ Ｍｒ） 约为９７ ０００ 的ＴＫ 和β半乳糖苷酶（ Ｍｒ５５ ０００） 融合蛋白。薄层扫描显示，该融合蛋白含量占菌体蛋白总量的２７ ．４７ ％ 。

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因融合表达产物的免疫学特性研究

目的研究TK基因在真核细胞中的表达。方法应用已构建和表达的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV 1TK)融合蛋白免疫兔制备抗HSV 1TK血清 ,并以免疫印迹法鉴定其特异性 ,以免疫荧光法检测HSV 1TK基因在转染人肝癌细胞系中的表达。结果免疫印迹显示 ,自制和国外提供的抗TK兔血清 ,均能特异性地识别Mr 约为97000的TK融合蛋白。免疫荧光染色得到的结果满意 ,而且自制抗血清的效价和染色强度均优于国外提供的免疫血清。结论原核表达的HSV 1TK融合蛋白具有较好的免疫学活性 ;自制抗HSV

复合PCR系统检测间日疟原虫的应用研究

应用一种简易、快速的复合 PCR扩增系统检测间日疟原虫 (P.v)及混合感染。方法 :以间日疟原虫和恶性疟原虫 (P.f)小亚单位核糖体核糖核酸基因 (SSUr DNA)特定片段为靶基因 ,设计并合成引物 ,建立复合 PCR扩增系统。采用煮沸法快速制备 DNA模板研究该系统的敏感性和特异性 ,并用于临床血样的检测。结果 :从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出分子量大小为 70 5bp和 575bp的特定扩增带。而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现。单独检测 P.v敏感度达到 0 .1 5× 1 0 -5(约 7个原虫 /μl全血 ) ,在 P.f存在的情况下检测 P.v敏感度为 0 .1 5× 1 0 -4 。检测 1 32例疟区门诊病人冻存血标本 ,1 0 4份与镜检法结果相同。并发现 1 4份混合感染和 5份为镜检虫种鉴别失误。结论 :该系统敏感性高 ,特异性强 ,操作简单 ,并可在一次扩增中同时检出间日疟原虫和恶性疟原虫 ,具有一定的推广应用价值。

恶性疟原虫GBP130基因5′侧翼序列近端片段调控功能的初步研究

为分析血型糖蛋白结合蛋白１３０（ＧＢＰ１３０）基因５′侧翼序列近端片段的调控功能，以质粒ｐＧＢＰＣＡＴ△２为模板应用ＰＣＲ将５′侧翼序列近端片段删除，构建该片段缺失的质粒载体ｐＧＢＰ△２／６１５，将 ｐＧＢＰＣＡＴ△２和 ｐＧＢＰ△２／６１５分别转染Ｐ．ｆ环状体，比较两者中报告基因 ＣＡＴ的表达水平，从而推知该片段对基因表达强度的影响．结果表明，ｐＧＢＰ△２／６１５转染的疟原虫表达报告基因 ＣＡＴ的水平下降，与ｐＧＢＰＣＡＴ△２转染的疟原虫相比有显著性差异（Ｐ＜０．０５）．说明该片段在ＧＢＰ１３０基因的表达调控中具有非常重要的作用。

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1糖蛋白BgB胞浆区蛋白并制备其特异性抗体。方法从感染HSV-1的BHK细胞中提取总RNA用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Westernblot鉴定。结果用IPTG诱导后,表达出相对分子质量Mr约42000的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1400。结论获得重组HSV-1gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础。

重组表达的恶性疟原虫顶端膜抗原1片段诱导小鼠保护性抗体应答

目的 分析恶性疟原虫顶端膜抗原(apical membrane antigen 1,AMA1)主要结构域在诱导保护性抗体应答中的作用,为正确选择疫苗应用片段提供依据。方法 PCR扩增编码P.fAMA1相应结构域的基因序列,构建pET原核表达载体,用纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定抗体效价,用免疫荧光和免疫印迹分析抗体的特异性,用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验。结果 成功表达并纯化了代表AMA1不同结构域的重组抗原片段,包括完整的胞外域片段E、结构域Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,免疫小鼠后分别诱导出不同滴度的IgG抗体,免疫血清可特异地识别天然AMA1抗原,重组蛋白E和Ⅰ+Ⅱ免疫血清可明显抑制疟原虫的体外生长。结论 AMA1胞外结构域的完整性是构成保护性抗体表位的重要基础,保护性抗体表位主要分布在结构域Ⅰ中。

应用计算机技术实现人体寄生虫学教学最优化

计算机多媒体技术和网络教学是当今计算机应用于教学的两大热点。我们充分利用这二者各自的优势 ,取长补短 ,优化教学资源和教学过程 。

约氏疟原虫53kDa抗原对小鼠的保护性免疫作用

目的 :探讨白细胞介素 - 2 ( IL- 2 )与约氏疟原虫 ( P.y)纯化抗原 53k Da抗原的免疫作用。方法 :用 53k Da抗原加福氏完全佐剂 ( FCA)腹腔注射免疫 BALB/ c小鼠 3次 ,每鼠再用 P.y非致死株 10 5感染红细胞攻击。观察免疫过程中和原虫攻击后第 6、12、18d脾细胞的刀豆球蛋白( Con A)或抗原体外诱生的 IL - 2水平变化及其与血中原虫率的关系。结果 :用 53k Da抗原免疫鼠 ,免疫结束时的 IL- 2诱生水平明显高于未免疫对照组 ,原虫攻击感染后免疫组的原虫率峰值为1.9% ,明显低于佐剂对照组的 2 5.4 %和未免疫组的 2 6.1%。结论 :P.y 53k Da抗原可产生明显的保护性免疫。