多花蔷薇假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生

以多花蔷薇‘无刺3号’成熟种子为外植体,探讨了假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生的方法。结果表明,种子的子叶在添加2,4-D0.5-2mg·L^-1的1/2MS培养基上暗培养30d后所产生的愈伤组织,接种到添加TDZ5-20mg·L^-1的1/2MS培养基上光培养20d产生初级假珠芽。假珠芽在添加TDZ10mg·L^-1和GA30.1mg·L^-1的诱导培养基上暗培养20d后,在含麦芽糖的无植物生长调节剂的培养基上光培养产生少量次级假珠芽和胚性愈伤组织。假珠芽保存在诱导培养基上。胚性愈伤组织可发育成大量正常体细胞胚,继而再生正常植物。假珠芽可通过上述方法不断诱导体细胞胚和假珠芽,通过这种方法假珠芽已经保存了2年。

香水月季类原球茎(PLBs)途径再生植株的研究

以香水月季(Rosa odorata)的嫩叶为外植体,采用MS基本培养基,添加不同质量浓度的2,4-D、TDZ和IBA,研究了类原球茎再生植株的效果。主要步骤如下:1)嫩叶在MS+2,4-D1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+Gelrite3 g/L培养基上暗培养4周,愈伤组织诱导率达100%,愈伤组织上的类根体(rhizoid)发生率最高,生成率可达71%。2)类根体在含TDZ的培养基(1/2 MS+TDZ 13 mg/L+蔗糖30 g/L+Gelrite 3 g/L)上,分化成类原球茎束,诱导率达71.0%,平均类球茎束为2.1。3)类原球茎在含IBA的培养基(MS+BA 2.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L+GA 3 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+Gelrite 3 g/L)上,发育出小植株,萌发率为29.3%;不能萌发的类原球茎上有白色假珠芽产生。白色珠芽可进行增殖、脱分化、再分化出芽,其植株再生率为46.7%。4)再生苗的生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L,生根率为100%。5)小苗经驯化后移栽到灭菌草炭土∶蛭石(体积比为1∶1)基质上,成活率为95%。

根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇(Rosamultiflora‘Inermis4’)的基因表达分析

多花蔷薇无刺4号(Rosamultiflora‘Inermis4’)对根癌病有较强抗性。以根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接种多花蔷薇无刺4号为目的材料,刺伤处理为对照,采用抑制差减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法,构建了富集多花蔷薇根癌病抗性相关基因的差减cDNA文库。差异筛选差减cDNA文库后,随机选取增强表达的92个克隆进行测序,去除冗余的cDNA和病菌的基因片段,共得到53个单一序列。利用GenBank数据库进行核酸和蛋白质同源性比较,获得的cDNA片段功能涉及:细胞分裂、生长(22个克隆),逆境防御、信号转导及激素调节(11个克隆)以及初生与次生代谢(10个克隆)。另有10个基因片段功能未知,可能为新的EST。根据测序及比对分析结果,对多花蔷薇无刺4号抗根癌病的分子机理进行了探讨。

根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立

在建立北海道黄杨(Euonymus japonicus ‘CuZhi’)再生体系的基础上,建立其遗传转化体系,以获得转雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因植株。采用根癌农杆菌(Agr-robacterium tumefaciens,LBA4404菌株)介导法,研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明,预培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中,不经预培养,根癌农杆菌浓度OD600=0.6,侵染下胚轴40min,再共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。抗性植株经PCR和DNA-Southern blot检测表明,目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。

多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

利用多花蔷薇‘无刺3号’假珠芽诱导的胚性愈伤细胞悬浮系分离得到原生质体,并培养获得再生植株。最佳酶液组成是2.0%纤维素酶,0.5%离析酶,5.0mmol·L-1MES,0.5mol·L-1甘露醇,0.5%CaCl2.2H2O。采用继代3d的悬浮细胞系,酶解10h,原生质体产量最大(26.67×106·g-1),活力最高(92.21%)。采用液体浅层培养,肌醇比蔗糖更有利于纯化后的原生质体分裂和生长。愈伤组织形成增殖培养基为1/2MS+1.0mg·L-12,4-D+0.2mg·L-1EBR+10g·L-1Ficoll+500mg·L-1谷氨酰胺+20mg·L-1甘氨酸+20mg·L-1天冬氨酸,在1/2MS+10mg·L-1TDZ+500mg·L-1谷氨酰胺+20mg·L-1甘氨酸+20mg·L-1天冬氨酸培养基中分化培养后转入1/2MS培养基上获得完整植株。

粉团蔷薇叶片不定芽的直接诱导及植株再生

粉团蔷薇(R.multiflor avar.cathayensis)是多花蔷薇的一个变种,既可以用作切花月季的优良砧木,又是园林绿化的景观材料。本研究以粉团蔷薇的无菌苗叶片为外植体,建立了其高效离体再生体系。实验以MS为基本培养基,附加不同激素(6-BA、TDZ、NAA)和培养条件(光、暗),诱导叶片直接再生不定芽。结果表明:高浓度的细胞分裂素和高浓度的生长素相配合对不定芽的诱导有显著影响;暗培养可以促进不定芽的诱导。适宜粉团蔷薇叶片不定芽再生的培养基为MS+4mg/L6-BA+0.5mg/LTDZ+1.0mg/LNAA;不定芽增殖培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.004mg/LNAA;生根培养基为1/2MS+0.2mg/LNAA,生根苗经移栽后成活率为85%。

狗蔷薇类原球茎发育过程的显微观察

对狗蔷薇类原球茎发育进行显微观察的结果表明:类原球茎发育过程中外部形态发生了明显的变化;毛状不定根及其产生的类原球茎均具备根的结构特点;类原球茎由毛状不定根中维管柱顶端外围的中柱鞘薄壁细胞发育而来,是包括胚性细胞和薄壁细胞在内的囊腔状结构的复合组织,胚性细胞在类原球茎中的发育经历了原胚、球形胚、心形胚和鱼雷胚阶段,并且与周围的细胞存在明显的生理隔离;类原球茎具有明显的极性,并且可以重复发生形成次类原球茎。

狗蔷薇类根体和类原球茎发生发育的组织学研究

以狗蔷薇叶片为对象观察其类根体和类原球茎发生发育的过程。发现叶片外植体叶柄维管束的原形成层细胞在2,4-D的诱导下分裂并扩大形成狭长的微管组织细胞,进一步衍生形成根源基细胞,根源基细胞分裂形成根尖分生组织,并最终形成类根体。类根体具有根冠、生长点、伸长区和根毛区,类根体只有初生结构,不具备次生结构。携带有愈伤组织的类根体在含TDZ的1/2MS培养基和光照协调作用下,根尖分生组织消失并分化成成熟的薄壁细胞,中柱鞘上部的细胞形成胚性愈伤组织,其分化为胚性细胞并形成新的分生中心,突破皮层和表皮,进而形成类原球茎。