10株新城疫病毒分离F基因的克隆及遗传变异分析

对10株具有一定代表性的NDV分离株的F基因进行RT＿PCR扩增和序列测定,核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明:F基因核苷酸序列的同源性为93.6%,推导氨基酸序列同源性为95.39%;根据F基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中2株属于弱毒株,8株属于强毒株,该结果与致病性试验测定的结果完全相符;不同年代、不同宿主分离株的F基因序列一致,高度保守。通过BLASTSEARCH比较,8株强毒株与广东鹅分离株GDGO(Y97)高度同源,处于进化树的同一分支。2株弱毒分离株与LaSota疫苗株仅有1～4个氨基酸改变,推测可能是免疫或散播LaSota疫苗株。抗原性指数分析表明HI分离株有三处明显变异,抗原位点推测分析表明H分离株比F48株和LaSota多出6个抗原位点,而Liu株抗原位点在446位后缺失。

近年来典型ND分离株的致病性和抗原性变异研究

8株ND分离株经过毒力测定 (MDT小于 4 7h ;ICPI大于 1.6 5 )均属于NDV强毒 ,交互凝集抑制试验表明 :分离株与C3 0 和F48株在HI效价上差 1～ 3个滴度 ;攻毒试验表明不同毒株致病性明显不同 ;鸡胚中和试验则表明 ,LaSota单因子血清对分离株有中和作用 ,但中和滴度有明显差异。

我国自主研制畜禽二维码标识诞生

今年11月农业部在全国推行了我国自主研制的畜禽二维码标识、电子阅读器以及疫病追溯系统,这是目前世界上最先进的畜禽标识。该技术为农业部正在执行的畜禽免疫标识和免疫挡案制度提供了可靠的技术支持。畜禽二维码标识以电子阅读器识读、记录并直接传输到国家信息中心计算机,进行汇总分析。其作用是:一、耳标条形码可以用电子阅读器直接阅读、保存,不需人去逐个观察记录;二、编号全国统一,如同人的身份证一样每头(只)动物身份号码全国唯一,没法造假和重复;三、全部信息直接联网传输、存档,省去繁重的人工汇总分析;四、系统承载免疫、检疫、饲养场、健康状况等信息,便于疫病追溯,及时控制和消灭疫病;第五,条形码通过电子阅读器打印,作为畜禽产品的检疫标识,便于畜禽产品质量追查和监督。畜禽标识与疫病追溯系统是实施科学检疫的基础和保障,是构建控制和消灭重大动物疫病长效机制的重要内容和关键措施。文章指出,疫病溯源要靠科学检疫来完成,而目前的检疫手段原始,如果检疫工作上不去,畜禽标识和疫病追溯系统的作用就会大打折扣,这也是政府在推行这套系统中需要首先解决的问题。

山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查

为了解山东省仔猪病毒性腹泻的流行状况,本研究根据Gen Bank中登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRo V）序列,分别设计扩增引物,采用RT-PCR方法对2013年10月～2014年10月采集的226份腹泻样品进行检测。结果显示226份病料样品中,PEDV、TGEV及PRo V的阳性率分别为34.96%、2.21%及28.76%,并且不同季节PEDV和PRo V均有感染,表明PEDV和PRo V是引起山东省仔猪腹泻的主要病原,并且山东省PRo V的感染率明显高于全国。规模化猪场与散养户相比,PEDV、TGEV及PRo V 3种病原的检出率明显降低,而且相对于未免疫腹泻二联苗的母猪,免疫母猪生产的仔猪发生腹泻后,该病原的检出率有所降低,表明合理的饲养环境和免疫对该病具有有效的防控作用。

半定量检测新城疫抗体胶体金试纸条的研制

为建立半定量快速检测新城疫抗体方法,本研究利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成胶体金颗粒,应用直径20nm的胶体金颗粒标记新城疫抗原,制作了半定量快速测定新城疫抗体的免疫胶体金试纸条。用试纸条检测60份样品,检测结果与血凝抑制试验(HI)法测得结果的符合率为93.8%,最小检测HI滴度为4log2,与其他病毒的阳性血清没有交叉反应,且室温下有效保存期为3个月。试纸条应用方便、快速,适合临床推广以及流行病学调查。

TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒

应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。

山东省2012年～2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及对其ORF3基因分析

为了解山东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行情况,本研究采用RT-PCR的方法对2012年1月~2016年12月山东省13个地市采集的258份疑似PEDV感染样品进行检测,并设计引物扩增PEDV ORF3基因片段,通过生物信息学软件对26个具有代表性的完整的PEDV ORF3基因序列进行遗传进化分析。结果显示PEDV平均每年检出率达72.1%,表明PEDV是当前山东地区仔猪腹泻的主要致病病原。遗传进化分析显示,26株PEDV ORF3基因序列属于G2基因型,与其它参考PEDV病毒株同源性较高(93.8%~100%),相对保守。其中3株PEDV流行株位于2a亚型中,这在华北地区属首次报道。PEDV 2a亚型基因序列具有特异位点突变,可作为鉴别2a亚型与其它亚型的分子标记。本研究揭示了山东省PEDV流行株ORF3基因的主要基因型,为该省PEDV的防控提供依据。

不同日龄猪伪狂犬抗体跟踪监测与分析

采用伪狂犬gB抗体ELISA检测试剂盒对一规模化猪场的4头母猪所产整窝仔猪从出生到出栏进行伪狂犬抗体跟踪监测,掌握了伪狂犬抗体的消长变化,发现仔猪断母源抗体可以维持至30 d以上,确定了仔猪伪狂犬疫苗的初免时间为35 d左右,并同时进行伪狂犬gPI抗体检测,了解了各个阶段的野毒感染情况。

山东省地方黄牛品种的遗传多样性研究

测定了山东省地方黄牛品种渤海黑牛和鲁西黄牛19头个体线粒体DNA(mtDNA)控制区(D-loop)的全序列,结合两个品种已报道的16个序列,用Lasergene、Mega 4.0和Dna SP 4.90软件对所得序列进行分析、构建进化树。结果显示:发现了29个单倍型,83个核苷酸多态性位点,转换/颠换比为4.27。山东黄牛主要有两个母系来源:欧洲牛和印度瘤牛,但受欧洲牛的影响更大一些。表明:山东地方黄牛品种具有丰富的遗传多样性和较高的进化潜力。

禽流感病毒血凝素分子生物学研究进展

禽流感病毒基因组由 8条单性负链RNA组成 ,血凝素基因是禽流感病毒基因组中变异最大的基因 ,禽流感病毒的抗原性和致病性很大程度上取决于该基因的变异情况。血凝素在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用 ,但可刺激机体产生中和抗体来中和病毒的感染力 ,而且血凝素诱导机体产生的体液免疫反应 ,对宿主抵抗禽流感起到了决定性保护作用 ,使目前研制血凝素基因工程疫苗成为禽流感病毒疫苗的研究热点。血凝素发挥功能之前必须裂解为两条肽链 HA1和 HA2 ,其裂解位点的氨基酸残基的组成是决定禽流感病毒致病力高低的主要因素。文章主要从血凝素的基因及其编码的蛋白、裂解位点序列和基因疫苗等角度对禽流感病毒血凝素分子生物学的研究状况进行了综述 。

IL-2真核质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗猪体免疫反应的分子佐剂效应

为研究猪IL-2真核表达质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗(Lactobacillus acidophilusSFMD-1)猪体免疫的分子佐剂效应,通过RT-PCR方法从猪的肠系膜淋巴结克隆猪IL-2基因,基于pRc/CMV2载体,构建编码猪IL-2的真核表达质粒pCSIL2,以RT-PCR方法分析了该质粒转染PK15细胞以后的mRNA表达。结果显示预期的429 bp IL-2带仅出现在pCSIL2转染细胞。试验猪单独免疫L.acidophilusSFMD-1或者联合免疫pCSIL2质粒,后者能够增强FMDV-VP1特异的T细胞和B细胞反应,免疫后5周,单独免疫组和联合免疫组的抗体水平分别为1.50和1.66;免疫后6周,抗体水平分别上升到1.83和2.28;在T细胞增殖试验中,L.acidophilusSFMD-1单独免疫组和pCSIL2联合免疫组的刺激指数(SI)分别为2.00和2.70。结果表明,联合应用IL-2真核表达质粒是改进乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗免疫原性和效能的有效方法。

伪狂犬病病毒Qihe547分离株主要保护性抗原基因序列的变异分析

2012年以来伪狂犬病（PR）在全国多省份暴发。为了解流行PR病毒（PRV）主要保护性抗原基因的变异情况,本研究从山东齐河地区经PRV Bartha-K61疫苗株免疫猪群中分离到一株PRV命名为Qihe547株,并采用PCR方法对该病毒分离株编码主要保护性抗原糖蛋白gB、gC和gD基因进行扩增及测序分析。结果显示,该病毒株与新近PRV分离株同属基因Ⅱ型。与Bartha株相比,Qihe547分离株在gB的优势抗原表位区（aa59~aa126）、gC膜外区（aa23~aa453）和gD主要抗原表位区,潜在的抗原位点及O-糖基化位点存在明显变异,推测这些变异可能影响Qihe547分离株的抗原性,利于病毒逃避宿主免疫反应,也可能是Bartha-K61疫苗诱导产生的中和抗体不能完全中和病毒的原因之一。本研究为PRV的有效防制及其疫苗研制提供了相关的数据。

高致病性禽流感的诊断与防制

禽流感是禽流行感冒的简称,是由A型流感病毒引起禽的一种病毒病。A型流感病毒可引起禽类急性死亡及高死亡率,危害极大,因此被称为高致病性禽流感。高致病性禽流感的诊断禽流感点式发生、跳跃式流行,易发于10月至次年3月,鸡、鸭、鹅、野鸡、鹌鹑、

荧光定量PCR检测雏鹅人工感染鹅细小病毒后病毒在体内分布规律

2005年从山东某鹅场16日龄商品代病死鹅中分离到1株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为SD2005株。用建立的荧光定量PCR(FQ-PCR)检测鹅细小病毒的方法,检测SD2005株人工感染3日龄雏鹅(GPV抗体阴性)后各器官不同时间段的病毒含量,结果表明:在攻毒8h后能从消化系统及血液、心脏和肝脏中检测到病毒DNA;病毒DNA的含量在48h后达到最高峰,并一直维持到168h。随后各待检脏器中病毒DNA含量持续降低,但在720h后仍能从粪便、肝脏和脾中检测到少量的病毒DNA。本试验为阐明GPV的致病机理及防控提供了重要的试验数据和理论依据。

单抗标记检测新城疫病毒免疫胶体金试纸条的研制

利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒标记单克隆抗体4E8,用兔抗鼠二抗喷洒在硝酸纤维素膜上作为对照线,用另一株单抗5E6作为检测线,制备成胶体金试纸条。用试纸条检测120份泄殖腔样品,结果与病毒增殖后HA法测得的结果符合率为95.8%,HA效价在1∶2以上,试纸条均能检测为阳性,与其他病毒的阳性血清没有交叉反应,且室温下可有效保存6个月。试纸条应用方便、快速,适合临床推广以及流行病学调查。

以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建

应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。