富含萝卜硫素的西兰花提取物对小鼠外周血CD8^(+)T淋巴细胞活化及肠道菌群的影响

目的:探讨富含萝卜硫素(SFN)的西兰花提取物对小鼠肠道菌群及外周血CD8^(+)T淋巴细胞活化的影响。方法:将15只C57BL/6N小鼠随机分为空白对照(CON)组、阴性对照(NC)组和SFN组,每组5只小鼠,分别给予蒸馏水、不含SFN的西兰花提取物、含0.3 g/L SFN的西兰花提取物125μL灌胃,连续4周。每2 d测量1次体重。实验结束前采集小鼠外周血检测活化的CD8^(+)T淋巴细胞百分比以及CD8^(+)T淋巴细胞中IL-2、TNF-α的含量。收集小鼠粪便,进行肠道菌群分析。结果:3组小鼠不同时间点体重差异无统计学意义(P>0.05)。SNF组小鼠外周血活化的CD8^(+)T淋巴细胞百分比、CD8^(+)T淋巴细胞中IL-2和TNF-α含量高于CON组和NC组(P<0.05)。3组小鼠肠道菌群组成存在差异,SFN组小鼠肠道中疣微菌门及阿克曼菌属的相对丰度高于CON组和NC组(P<0.05)。肠道中阿克曼菌属的相对丰度与CD8^(+)T淋巴细胞中IL-2和TNF-α含量呈正相关(r=0.934和0.664,P<0.05)。结论:长期连续服用富含SFN的西兰花提取物能增加小鼠肠道中阿克曼菌属等有益菌的丰度,同时可增强外周血CD8^(+)T淋巴细胞的功能。

TWS119联合细胞因子促进CD8^+记忆性T细胞分化及功能

目的:探讨TWS119联合不同组合细胞因子对CD8^+T细胞分化、表面分子表达、细胞因子分泌及抗凋亡能力的影响。方法:采用密度梯度离心法获取健康供者外周血中单个核细胞,磁珠分选CD8^+T细胞。体外采用IL-7、IL-15、IL-21及TWS119等不同组合方式培养。采用流式细胞术检测CD8^+T细胞亚群比例、表面分子表达水平、细胞内因子分泌及细胞凋亡情况。结果:与其他组合相比较,IL-7+IL-21+TWS119联合处理CD8+T细胞后,干细胞样T细胞亚群比例显著增加;同时,CD8^+T细胞表面激活型标志物CD28和CD27表达水平增加,抑制型分子PD-1和Tim-3表达水平下调(P<0. 05);同时,采用IL-7+IL-21+TWS119处理显著增加CD8^+T细胞中胞内因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平(P<0. 05)以及显著降低凋亡细胞的比例(P<0. 05)。结论:TWS119联合细胞因子IL-7和IL-21促进CD8+T细胞向记忆亚群分化,同时增强其抗肿瘤效应。

萝卜硫素对HER2 CAR-T细胞分化、细胞内因子分泌及抗肿瘤作用的影响

目的:探讨萝卜硫素(SFN)对靶向人类表皮生长因子受体-2(HER2)的嵌合抗原受体修饰T细胞(CART)分化、细胞内因子分泌、抗肿瘤能力的影响。方法:采用密度梯度离心法及细胞免疫磁珠分选健康供者外周血CD8^+ T细胞,制备HER2 CAR-T细胞,用15μmol/L SFN处理72 h后检测其分化情况。将HER2 CAR-T细胞与A549共孵育,检测HER2 CAR-T细胞内IFN-γ和TNF-α的表达及A549细胞的凋亡,采用qRT-PCR检测细胞糖酵解途径相关酶[己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶(PFKM,PFKP)、丙酮酸激酶(PKM)]及脂肪酸氧化过程相关酶[肉毒碱棕榈酰基转移酶(CPT1A)]mRNA的表达。以未经SFN处理的细胞作为对照。结果:与对照组相比,SFN组中心记忆性T细胞亚群比例增加(P <0. 05),IFN-γ及TNF-α分泌水平增加,对A549细胞的杀伤能力增强(P <0. 05),HK2、PFKM、PFKP和PKM mRNA表达下调,CPT1A mRNA表达上调(P <0. 05)。结论:SFN通过抑制糖酵解途径促进HER2 CAR-T细胞向记忆亚群分化,同时增强其抗肿瘤效应。

不同亚群CD8^+ T细胞表型、功能分子及分化相关基因的表达

目的:探讨不同亚群CD8^+ T细胞的表型、功能分子及分化相关基因表达的差异。方法:密度梯度离心法从健康人外周血中分离外周血单个核细胞,并用MACS细胞免疫磁珠分选获取CD8^+ T细胞。采用CD3、CD8、CD45RA、CCR7标记CD8^+ T细胞亚群,检测各亚群表面标志物(CD69、CD28、PD-1)及功能分子(IFN-γ、IL-2)的表达;采用qRT-PCR检测CD8+T细胞亚群中功能、转录因子、凋亡及干性等相关基因的表达。结果:与效应记忆性T细胞(Tem)和效应性T细胞(Teff)相比,中心记忆性T细胞(Tcm)表面激活性标志物CD69和CD28表达水平增高(P <0. 05),而抑制性分子PD-1表达水平降低(P <0. 05);功能分子(IFN-γ、IL-2)的表达水平上调(P <0. 05);趋化因子受体(CCR7、CXCR4)、STAT3、干性基因(C-myc、Lin28)及抗凋亡等相关基因表达水平上调(P <0. 05)。结论:抗凋亡、自我更新、STAT3等相关基因在Tcm细胞中高表达,且与记忆性T细胞的分化相关,为体外诱导记忆性T细胞提供了基础。

食管癌组织中IDO1的表达及犬尿酸对间皮素CAR-T细胞功能的影响

目的:探讨食管癌组织中吲哚加双氧酶1(IDO1)的表达,及其代谢产物犬尿酸对间皮素嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)功能的影响。方法:利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库中数据分析食管癌组织中IDO1的表达对患者生存的影响;采用密度梯度离心法获得健康供者外周血单个核细胞,并用细胞免疫磁珠分选出CD8+T细胞;采用病毒感染的方法制备间皮素CAR-T细胞,用200μmol/L犬尿酸处理48 h后,采用流式细胞术检测细胞表面标志物的表达和细胞内因子分泌的水平,检测其对KYSE510细胞的杀伤能力。以未用犬尿酸处理的间皮素CAR-T细胞作对照。结果:高表达IDO1的食管癌患者预后较差。与对照组相比,犬尿酸处理组间皮素CAR-T细胞表面抑制性分子PD-1表达上调(P <0. 05),而激活性分子CD28表达下降(P <0. 05),效应因子IFN-γ和IL-2分泌减少(P <0. 05);与KYSE510细胞共孵育后,间皮素CAR-T细胞CD107a表达降低,杀伤能力下降(P <0. 05)。结论:犬尿酸可以抑制间皮素CAR-T细胞的功能。

嵌合抗原受体T细胞治疗相关细胞因子释放综合征小鼠模型的建立

目的建立嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗相关细胞因子释放综合征(CRS)的小鼠模型。方法通过分子克隆及慢病毒转染技术,构建靶向人CD19分子的CAR-T细胞,采用流式细胞术检测CAR-T细胞转染效率,酶联免疫吸附试验(ELISA)法及流式细胞术检测CAR-T细胞特异性杀伤靶细胞的能力。通过尾静脉注射CAR-T细胞至荷瘤重症联合免疫缺陷裸鼠体内,小鼠分为磷酸缓冲液组、低负荷组(注射1×105个人淋巴瘤细胞Raji-Luc2细胞)和高负荷组(注射5×105个Raji-Luc2细胞)。采用动物活体成像法检测肿瘤治疗效果,ELISA法检测小鼠血清中细胞因子人白细胞介素2(IL-2)、人γ-干扰素(IFN-γ)、鼠IL-6、鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。结果经尾静脉注射人T细胞和T细胞+OKT-3抗体后,T细胞组和T细胞+OKT-3组小鼠的健康得分分别为(1.15±0.08)分和(2.90±0.15)分,差异有统计学意义(P<0.001)。T细胞+OKT-3组小鼠血清中人IL-2、人IFN-γ、人IL-15、鼠IL-6、鼠GM-CSF水平分别为(1064.00±50.14)、(1285.00±193.90)、(202.4±18.76)、(1478.00±289.20)和(350.70±42.27)pg/ml,均高于T细胞组[分别为(22.67±6.36)、(23.67±3.71)、(44.33±14.45)、(147.30±36.20)和(138.00±22.74)pg/ml,均P<0.05];OKT-3联合人T细胞引起小鼠血清中细胞因子人IL-2、人IFN-γ、鼠IL-6、鼠GM-CSF水平迅速升高,并伴有体温升高及体重下降。成功构建靶向CD19分子的CAR-T细胞,流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率>30%。ELISA结果显示,在CD19抗原存在时,CAR-T19细胞与Raji、Nalm-6共孵育组细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平分别为(561.00±37.07)、(680.30±71.27)、(369.00±25.71)和(523.00±26.31)pg/ml,均高于与K562共孵育组[分别为(55.00±20.53)和(64.00±7.55)pg/ml,均P<0.001]。小鼠成像实验显示,小鼠成瘤后第7天经尾静脉回输活化后的CAR-T19细胞,成瘤第13天,低负荷和高负荷组小鼠肿瘤荧光强度均低于接种肿瘤的第7天,高负荷组肿瘤荧光强度由144.00±24.69减少至5.02±2.35(P=0.005),低负荷组肿瘤荧光强度由58.47±9.36减少至3.48±1.67(P=0.004)。荷瘤小鼠注射CAR-T19细胞72 h后,血清中T细胞活化相关细胞因子人IL-2、人IL-15、人IFN-γ水平迅速增高,单核细胞相关因子鼠IL-16、鼠GM-CSF分泌增加,同时伴随有体温升高和体重降低等CRS典型特征。结论体外成功构建靶向CD19分子的CAR-T细胞,通过CAR-T细胞回输治疗验证了小鼠体内CRS现象的发生,为CAR-T细胞治疗相关CRS的发生机制及CRS预防策略提供了动物模型参考。