转录因子bZIP60调控植物抗病抗逆的研究进展

未折叠蛋白反应(UPR)在植物的逆境胁迫、病原物侵染、生长发育中发挥重要作用,转录因子bZIP60是UPR信号之一。在明确了拟南芥、水稻、玉米、小麦等内质网应激时需肌醇酶(IRE1)介导bZIP60 mRNA剪接激活的基础上,归纳了bZIP60对逆境和病原物的响应机制,总结了IRE1/bZIP60信号在植物抗病抗逆中的研究进展。正常生长条件下,以前体蛋白bZIP60U的形式跨内质网膜。发生应激时,IRE1识别并剪切bZIP60 mRNA的双茎环结构,产生含转录激活域和核定位信号的活性蛋白bZIP60S,并在细胞核内形成二聚体,结合到应激反应相关基因的启动子,通过上调胁迫应答相关基因提高植株抗性。

京津冀暖季短时强降水环境特征对比分析

利用2013—2021年暖季(6—9月)京津冀地区逐时降水资料和ERA5再分析资料,根据天气形势对短时强降水进行天气学分型,统计短时强降水发生的时空特征,对比动力、水汽和热力不稳定条件等环境要素特征。结果表明:短时强降水以冷涡型和副高型为主,占到55%,且主要发生在7月中下旬到8月上中旬,强降水主要集中在下午到前半夜。对比发现,不同类型短时强降水空间分布特征区别明显,分型合理;各类型大多表现为低层辐合和高层辐散,西南涡型动力强度表现最强,且随降水临近是增加的,弱天气强迫型在降水前各个时段动力表现最弱;副高型、台风型和西南涡型水汽最为充沛,副高型925 hPa比湿中位数达到19.14 g·kg~(-1),西南涡型在高低层相对湿度均较大,低层平均相对湿度中位数达到87%,弱天气强迫型相对较差,为74%,各类型整层大气可降水量在降水前随时间基本是增加的;弱天气强迫型的热力不稳定性最为突出,850 hPa和500 hPa温度差中位数最大为25.74℃,西南涡型最小,除弱天气强迫型外,各类型热力条件随时间是减弱的。

转录因子NbNAC062及其纳米药物对PVY侵染的抑制作用

前期研究表明NbNAC062能够抑制PVY早期侵染,本研究通过构建NbNAC062敲除突变体和过表达植株进一步明确NbNAC062的抗病毒功能,并利用异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate,FITC)标记的壳聚糖季铵盐(chitosan quaternary ammonium salt,HACC)包被NbNAC062质粒,制备HACC-NbNAC062纳米药物。激光共聚焦显微镜对纳米药物进行示踪;透射电镜和激光粒子分析仪对其表征进行分析。通过GFP荧光差异、qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测病毒含量来探明纳米药物对PVY侵染的影响。结果显示,敲除组病毒GFP荧光增强,而过表达组病毒GFP荧光减弱,PVY CP含量与上述结果一致。纳米药物粒径集中分布在18~32 nm之间;Zeta电位为+41.8 mV。浸润纳米药物HACC-NbNAC062后48 h,在细胞内观察到FITC-HACC(绿色荧光)与RFP-NbNAC062(红色荧光);接种PVY-GFP后5、7、9 d,NbNAC062-HACC施药组的PVY CP mRNA水平较对照组分别下调17.41%、47.81%、13.03%;第7天施药组PVY CP蛋白水平明显低于对照组,病毒荧光强度显著暗于对照组。上述研究结果说明HACC-NbNAC062纳米药物成功递送了NbNAC062,并发挥了其对PVY初期侵染的抑制作用。

辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)是发生在辣椒上的一种重要病毒病。通过逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),以PMMo V外壳蛋白CP序列为靶标基因,设计F3/B3、FIP/BIP 4条引物,构建了基于RT-LAMP技术的PMMo V快速检测方法。结果表明,该方法在60 min内便可完成对PMMo V的特异性检测,灵敏度比传统RT-PCR技术高10倍,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应。本试验建立的PMMo V RT-LAMP检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可用于田间生产中对PMMo V的快速检测。

青岛烟区马铃薯Y病毒株系鉴定及系统传导特性

为明确引起青岛试验田烟草脉坏死及花叶的PVY的发生规律、分子进化和系统传导特性,通过病毒病害表型,发病率和病情指数明确青岛试验田病毒病害流行规律;利用MEGA7构建系统发育树鉴定PVY青岛分离物的株系;通过q RT-PCR,western blotting和PVY-GFP荧光明确PVY侵染烟株的传导路径;通过不同叶位、不同症状病叶取样,利用q RT-PCR检测PVYCPm RNA相对含量,明确显症和隐症叶片的病毒含量差异,以及TMV、CMV、PVY单独、两者混合、三者混合侵染时的干扰或协生作用。结果显示:烟株成熟期,PVY与TMV和CMV混合发生严重,PVY分离物为N:O株系,未突破va基因抗性。在侵染早期,病毒从接种叶沿叶脉进入茎,开始双向运输时,先向根部移动,进而到达苗端;再扩散至上部叶,较慢移动至下部叶;最后伴随烟株生长持续向两端新生部位运输。侵染中期病株上部叶隐症现象显著,病叶症状与病毒浓度呈正相关。烟田中后期,PVY与TMV和CMV混合侵染,病毒间的干扰和协生作用导致症状复杂多变。研究结果有助于提高品种抗性鉴定试验的准确性和药效试验的靶标性。

解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用

从烟田土壤中分离得到解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba33菌株。5叶期三生NN烟（Nicotiana tabacum var．samsun NN）喷施Ba33发酵液3次后再接种TMV（烟草花叶病毒），与喷清水对照相比，能显著降低枯斑数量，枯斑抑制率为67．8％。于4～6叶期普通烟草（Nicotiana tobacum L．）NC89烟苗接种TMV前后分别用Ba33发酵液、NB培养基或清水连续灌根3次，观察到Ba33发酵液灌根处理的烟苗鲜重、最大叶长和叶宽均高于清水对照处理，叶色浓绿，长势良好；接种TMV10d后进行实时荧光定量PCR检测．Ba33发酵液灌根处理的植株新叶中RNA含量低于清水对照和NB培养基灌根处理。认为Ba33具有拮抗TMV、促进烟草生长的作用．是具有潜在应用价值的生防菌株．

拮抗细菌对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究

从发生烟草花叶病毒(TMV)的烟田耕作层土样中分离到对TMV有拮抗作用的菌株By33和By88。生物测定试验表明,By33和By88的无菌发酵液对TMV的体外抑制作用分别为81.81%和83.29%,涂抹菌液24 h后接种TMV,仍有73.01%和66.98%的预防作用。硫酸铵沉淀无菌发酵液、PBS透析获得拮抗蛋白;拮抗蛋白对TMV的体外抑制作用分别为85.38%和87.47%,并且在274.00 nm处有明显的蛋白吸收峰,为典型的蛋白质吸收光谱。此外,通过叶圆片法和透析法生物测定表明,抗病毒蛋白与TMV粒子结合作用为不可逆,有抑制TMV在烟株体内复制的作用。

川硬皮肿腿蜂的胚胎发育

在 2 6℃恒温和 70 %相对湿度条件下 ,川硬皮肿腿蜂胚胎发育全历期为 60～ 70h。卵黄少 ,原足期 (protopod)孵化。根据其胚胎形态变化特征可分 4个发育阶段 :早期发育阶段 ,卵产后 1～ 1 2h,包括卵割期、胚盘期和胚带期 ;胚胎伸长及器官发育阶段 ,卵后 1 2～ 5 0h,包括胚带分节、原头原躯分化、胚带再伸长、消化道和口器形成 ;胚胎背合阶段 ,卵产后 5 0～ 60h和胚胎成熟阶段 ,卵产后 60～ 70h。

一株烟草花叶病毒生防细菌的鉴定及代谢物活性研究

从烟田土样中分离到1株对TMV有拮抗作用的细菌By33,通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。通过对By33代谢产物对TMV抑制作用测定发现,其代谢物质对温度敏感,80℃处理30 min,丧失大部分活性,遇酸沉淀,碱性条件下稳定,对蛋白酶不敏感。

荧光假单胞菌CZ对TMV的抑制作用及其活性蛋白的分离纯化

从烟草根际中分离到一株拮抗烟草花叶病毒(TMV)的生防菌荧光假单胞菌CZ,将其发酵液接种或喷施TMV寄主三生NN烟后进行生物学检测。结果表明:荧光假单胞菌CZ发酵液与TMV混合后接种,其枯斑抑制率为91.5%;接种TMV的前、后24 h喷施CZ发酵液,对TMV的抑制率分别为78.9%和30.5%。荧光假单胞菌CZ发酵液经硫酸铵盐析获得活性粗蛋白,经阴离子层析、superdex-G-75凝胶层析和SDS-PAGE检测,分子量为39.4 kD。

生防菌混合培养液对烟草普通花叶病毒的抑制作用

由烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）引起的病毒病是烟草上发病早、传播快的主要病害之一,农事操作机械接触传染及土壤病残传毒是TMV的主要流行因子。为应用生防菌进行土壤和工具消毒,对已筛选的5株生防菌（Ba、CZ、A3、4A1、2A2）,将其单菌株培养液及菌株两两混合接种后的培养液与TMV等体积混合,采用摩擦接种枯斑寄主三生NN烟的侵染力测定法进行菌株活性比较。结果显示,5株生防菌培养液及两两混合接种后的培养液对TMV均有较强的抑制活性,与NB培养基对照相比,其5倍稀释液对TMV的抑制效果为94%~99%,以CZ＋2A2混合接种培养液对TMV抑制效果最好,50倍稀释液防效为74.9%。具备单独或混合培养制备土壤消毒剂用以工具及苗床和大田土壤消毒的潜力。

烟草黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ分离物生物学特性

对引起花叶狭长及疱斑畸形重症的烟草黄瓜花叶病毒,采用生物学接种、CP基因扩增测序、电镜观察、免疫印迹、荧光定量等方法,研究病毒分离物的株系、粒体形态、致病力、稀释限点、传导路径以及在抗感烟草上的症状。结果显示,分离物外壳蛋白基因长度为657 bp,其核苷酸序列与亚组Ⅱ的代表Q株系同源性为69.83%,与亚组Ⅰ的代表Fny株系同源性为93.00%,介于ⅠA与ⅠB株系之间。病毒粒体球形,直径28~30 nm,对烟草致病力强。病汁液稀释限点为10-5,质量浓度40倍稀释接种后病毒由接种叶移动到主茎后,先向下至根、向上至心叶,再扩散布满全株,最后集中在上部叶。亮黄和G28对其表现高感,病叶狭窄、黄化斑驳、变薄革质化及疱斑畸形;Ti245和铁耙子表现中抗,病叶轻微脉明斑驳。

拮抗TMV菌株By33产抗病毒蛋白分离纯化及发酵特性研究

从烟田耕层土壤分离获得对TMV有拮抗作用的菌株By33。其无菌发酵液对TMV的体外钝化作用为81.81%,涂抹菌液24h后接种,仍有73.01%的防效;硫酸铵沉淀获得的活性粗蛋白对TMV体外钝化作用为85.35%。粗提蛋白液经PEG浓缩、凝胶过滤和柱层析分离纯化,再经SDS-PAGE电泳确定该蛋白分子量为27.5KDa,对TMV的钝化效果为80.8%。NB培养基在初始pH6.5、温度30℃、通气量150mL/500mL、180r/min发酵培养48h,产物活性最高。

拮抗TMV细菌发酵产物对TMV粒体形态的影响

通过对拮抗细菌发酵产物抑制TMV活性的测定及体外混合对TMV粒体形态的影响研究,表明:1)拮抗细菌by33、by88发酵产生的活性蛋白对TMV的体外钝化作用分别为85.38%和87.47%;2)电镜下观察到活性蛋白能打破TMV粒体的规则排列,与TMV粒子不可逆的结合,从而降低侵染力。

烟草突变体筛选与鉴定方法篇:2.烟草抗主要病虫害突变体的筛选与鉴定

参照烟草品种抗病性鉴定标准GB/T 23224—2008,烟草基因组计划重大专项＂烟草突变体创制、筛选与分析＂建立了烟草抗病毒病、青枯病、黑胫病、赤星病、烟蚜的高通量筛选方法,将全面开展烟草抗主要病虫害突变体的大量筛选与鉴定工作。

生防菌Ba33抑制烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的研究

采用realtime quantitative PCR方法测定了Ba33胞外蛋白对烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的抑制作用,结果显示:与接种TMV+PBS对照相比,Ba33蛋白与TMV混合接种、接种TMV前24h喷雾Ba33蛋白及接种TMV后6h喷雾Ba33蛋白,均能显著抑制叶片内RNA积累,其中以接种前24h喷雾Ba33蛋白抑制效果最好。

柳杉长卷蛾蛹期发育起点及有效积温的测定

在 5种恒定温度下观察了柳杉长卷蛾HomonaissikiiYasuda蛹的生长发育速率 ,应用“最小二乘法”测得柳杉长卷蛾蛹期的发育起点温度 (C)为 12 5℃ ,有效积温 (K)为 89 2 3日度。

一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD600值变化测定其对温度、p H、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1,噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1—2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目(Caudovirales),肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为ds DNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10—100 k D,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围(31—317 kb);生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28—50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在p H 3—8的范围内均有较强的裂解活性,当p H值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0—9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。

一株对TMV和PVY具有拮抗活性生防菌的筛选与鉴定

【目的】筛选对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)具有显著拮抗活性的菌株。【方法】从山东诸城等植烟区采集烟草病毒病高发区健康烟株中烟100(Nicotianatabacum var.Zhongyan 100)的根际土壤,分离抗TMV的活性菌株,通过生理生化测定和分子鉴定确定菌株。采用Real-time PCR技术定量检测该菌株对TMV和PVY的抑制作用进一步验证该菌株的抗病毒活性。田间试验进行3个处理,菌液与病毒混合,2 h后接种(I),喷菌液2 h后接种病毒汁液(II),接种病毒汁液2 h后喷施菌液(III),以8%宁南霉素和肥皂水分别与等体积病毒汁液混合为阳性对照,以LB培养基与病毒汁液混合为空白对照。利用菌株发酵液对剪刀上病毒的钝化作用进行验证试验。【结果】筛选到的菌株通过枯斑寄主半叶法显示其对TMV的抑制效果达98%以上,命名为4A1,分子鉴定结果显示该菌株16S rDNA序列与Pseudomonas monteilii的16s rDNA序列同源率达到99%;菌株4A1为革兰氏阴性,氧化酶、淀粉水解VP、吲哚等反应为阴性,明胶液化、葡萄糖反应为阳性,能运动,确定该菌株为蒙氏假单胞菌(P.monteilii)。Real-time PCR检测结果显示其发酵液对TMV、PVY具有显著的抑制活性。田间试验结果显示,处理I可有效降低大部分病毒侵染,TMV和PVY发病率分别为5.3%和7.7%,病情指数分别为0.8和2.9;处理II可显著减少TMV和PVY的侵染几率,发病率分别为33.3%和36.7%,病情指数分别为4.2和6.0;处理III烟株发病率为95.0%和92.0%,病情指数为24.5和20.1;CK组TMV、PVY发病率分别为99.3%和95.4%,病情指数为别为38.6和45.1。菌株对剪叶工具的处理,钝化病毒效果可达95%以上,防效显著高于其它处理。【结论】在烟叶生产上,该菌株可以作为生产工具的生物消毒剂和抗病毒剂。

烟草抗病毒病种质资源的鉴定与评价

2005-2006年采用温室苗期接种鉴定的方法对202份烟草种质进行了TMV、CMV以及PVY三种病毒病的抗性鉴定。结果表明:在供试种质中,对TMV表现免疫(21份)、抗病(1份)和中抗(30份)的材料共52份,表现中感(130份)和感病(20份)的材料共150份;对CMV表现抗性(4份)和中抗(20份)的材料共24份,表现中感(79份)和感病(99份)的种质共178份;对PVY表现免疫(1份)、抗病(2份)和中抗(33份)的材料共36份,表现中感(96份)和感病(70份)的材料共166份。所筛选的优质、抗病烤烟引进品种白色种、晒烟大るま以及香料烟KoKulu izmir可直接应用于烟草生产,另外对TMV表现免疫的材料白肋烟8301、黄筋蔸、抗3种病毒病的种质黄花烟阳高小兰花以及兼抗两种病毒病的种质可为烟草抗病毒病育种的亲本选择提供抗源。