Expi293F表达重组鲎C因子用于荧光法内毒素检测

鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原,在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难,且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子,并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6×His标签,同时用哺乳细胞表达载体中的分泌信号肽替换掉了原始C因子信号肽。构建好的重组质粒转染至人胚胎肾脏细胞Expi293F悬浮培养7 d后收获上清液,Western Blot检测蛋白与预测大小128 kDa一致,具有与内毒素结合以及结合后切割荧光底物的能力。该研究首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中成功表达出具有生物学活性的全长C因子,表达量达到19.18 mg/L,比DING在昆虫细胞SF9中的表达量提高了113%。该方法对于后续开发低成本内毒素检测试剂盒具有指导意义。

恶臭假单胞菌F1表达P450酶催化柠檬烯生物合成紫苏醇

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中皆可扩增并表达目的基因的广宿主载体,过表达选择性羟化酶CymAa、CymAb,异源表达特异性氧化柠檬烯生成紫苏醇的P450酶CYP153A6,并在表达P450酶的基础上对柠檬烯底物添加浓度进行了调整,与大肠杆菌BL21(DE3)一同进行柠檬烯生物合成紫苏醇实验,并使用紫外可见分光光度计和GC-MS分别测量菌株生长状况和紫苏醇产量。最终证明了恶臭假单胞菌F1在柠檬烯浓度为10 mmol/L内的环境中具有高耐受度,且添加1 mmol/L柠檬烯底物发酵48 h后获得最高产量75.6 mg/L,最高转化率达到49.66%,缩小了生物合成紫苏醇的底物添加范围,并获得对柠檬烯具有高耐受度的发酵宿主。

利用代谢工程在酿酒酵母中高效合成2-萘乙醇

【目的】为实现生物合成重要化合物2-萘乙醇,探索利于2-萘乙醇合成的基因组合。【方法】向酿酒酵母BY4741发酵液中外源添加2-萘丙氨酸,运用高效液相色谱法进行产物检测;绘制BY4741的生长曲线和产量曲线,添加不同浓度2-萘丙氨酸到BY4741发酵液中并检测BY4741生长和生产情况;对BY4741进行代谢工程改造,构建过表达Ehrlich途径6个基因的质粒并转化进BY4741中;发酵6株改造菌株,检测产物产量。【结果】发酵液中检测到了推测产物2-萘乙醇,代谢工程改造菌株相较于野生型BY4741菌株产量均有所提升,其中过表达ARO9和ARO10基因使得2-萘乙醇的产量在外源添加1 mmol/L 2-萘丙氨酸的情况下达到0.258 mmol/L,转化率达到野生型的2.3倍。【结论】在酿酒酵母中实现了2-萘乙醇的生物合成,探索出ARO9和ARO10是利于2-萘乙醇生物合成的基因组合,为工业生产2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法。

四种过氧化物酶体同工酶在毕赤酵母甲醇代谢中的作用研究

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),核糖-5-磷酸异构酶2(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-2),转醛醇酶2(transaldolase,Tal1-2),果糖-1,6-二磷酸醛缩酶2(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-2)。在验证其参与甲醇代谢的基础上,分别对4个酶基因进行单敲除、四敲除,并在四敲除菌中分别进行细胞质同工酶及过氧化物酶体同工酶的回补实验。结果表明4敲除菌在甲醇培养基中受到严重的生长抑制。而单敲除菌中,Fba1-2的缺失对菌株在甲醇培养基中的生长表型影响最大;同时,回补Fba1-2也能最大程度地恢复4敲除菌株的生物量。综上,Fba1-2是甲醇同化途径中的关键酶,且同化途径的过氧化物酶体区室化对甲醇代谢途径至关重要。此外,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Shb17)基因单敲除菌和TAL1-2基因单敲除菌的表型对比结果表明,更改的卡尔文循环是甲醇代谢中木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)再生的主要途径。该研究可为后续优化毕赤酵母甲醇利用途径提供理论依据。

大肠杆菌L-丝氨酸脱水酶的表达改善甘氨酸营养缺陷型毕赤酵母L-丝氨酸的生长

氨基酸作为一种迟效碳源无法被微生物快速利用。L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase,L-SerDH)可以将L-丝氨酸一步催化为丙酮酸和氨进入中心碳代谢生成生物量,且此过程不需要消耗ATP和还原力。L-丝氨酸是甲酸利用途径(还原性甘氨酸途径)的关键中间体。因此,改善L-丝氨酸的利用可以为甲酸和丝氨酸作为碳源利用提供参考价值。该文对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行了丝氨酸耐受性实验,结果显示毕赤酵母可以耐受20 g/L丝氨酸。对内源L-丝氨酸脱水酶在毕赤酵母中的表达进行了优化。在甘氨酸营养型毕赤酵母内分别表达了8种异源L-丝氨酸脱水酶,结果表示大肠杆菌tdcG基因编码的L-SerDH对丝氨酸利用改善效果最好,终OD 600提高至出发菌株的1.6倍。该研究验证了巴斯德毕赤酵母对L-丝氨酸的耐受性,并筛选得到了较优的L-丝氨酸脱水酶来源,为毕赤酵母的丝氨酸利用提供了更优的酶来源。

调控质粒拷贝数优化生物催化效率的研究进展

质粒作为外源基因异源表达的普遍载体,在合成生物学中广泛应用。不同质粒载体在细胞工厂中的拷贝数不尽相同,合理利用拷贝数不同的质粒可以优化目标基因表达水平,提高生物催化效率。针对天然质粒复制子系统的局限,近年来研究者们依据质粒复制机制,开发出了许多性能更优异的新质粒系统,显著提高了生物催化效率。该文结合质粒拷贝数在多种微生物细胞工厂中的应用进行综述,以期为合成生物学领域的相关研究提供参考和借鉴。

高通量平行发酵技术的发展与应用

21世纪初,为解决生物医药过程工程研究所面临的微生物和哺乳动物细胞培养的实验通量、研发效率与成本方面的问题,更重要的是质量源于设计(QbD)导向的生物过程工程实验设计(DoE)的迫切需要,基于微、小型生物反应器的平行发酵(细胞培养)技术与产品得到了广泛应用。近年来微生物代谢工程与合成生物学的飞速发展,对高性能菌种库的高通量筛选与菌种表型过程表现的早期评价提出了更高实验通量的需求,这进一步拓展了不同培养体积的平行发酵培养装置在工业生物技术领域的应用。时至今日,可模拟工业培养条件并实施过程参数准确控制的微小型反应器的多联罐平行发酵装置、系统操作软件和数据处理的集成系统已成为生物过程工程研发的强大工具,它在生物医药创新、代谢工程和合成生物学等基础研究成果向工业化技术转化中起到重要的支撑作用。特别是在合成生物学领域中,基于“工业相似性”原则的平行发酵技术,可以解决培养板或摇瓶高通量菌种筛选无法表征克隆表型、在规模化培养中的表现受培养过程参数显著影响的痛点问题,实现过程工程导向的高通量、高效率的菌种筛选与评价。本文对高通量平行发酵与细胞培养技术的发展近况与其在合成生物学研究中的应用场景做了介绍,其中主要总结了平行发酵培养技术在高通量菌种筛选评价“三段论”中的价值、平行发酵培养如何支持菌种筛选的工业相似性原则的实施、平行发酵培养结合DoE实验策略实施高效的生物过程工程开发、使用平行发酵培养建立过程多变元批次模型的方法,以及平行发酵培养与建立生物培养过程缩小模型的关系等。

基于紫色杆菌素生物合成途径的L-色氨酸生物传感器的构建

结合生物传感器进行高通量筛选是鉴定L-色氨酸高产菌株的有力工具,但现有的L-色氨酸生物传感器普遍存在工作范围和动态范围都较低的缺点。在大肠杆菌中表达紫色杆菌素生物合成途径,测试不同来源的VioA酶,结合RBS工程,开发了一种新型酶偶联L-色氨酸生物传感器。测试发现来自Chromobacterium violaceum的VioA酶可使该传感器的检测上限扩大至10 g/L外源添加的L-色氨酸;将其RBS的初始翻译速率降低到约2000时,传感器的动态范围扩大到55倍;通过肉眼可直观地区分L-色氨酸产量不同的大肠杆菌菌株。这种新型的L-色氨酸生物传感器可结合高通量筛选等手段,在鉴定L-色氨酸及其高附加值衍生物高产菌株等方面发挥巨大作用。

基于异戊烯基焦磷酸异构酶的改造及表达优化提高异戊二烯产量

异戊二烯是最简单的萜烯类化合物,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。针对关键酶-异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的活性低等问题,该研究从酶工程、启动子工程和核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)工程3个方面对IDI的表达进行了优化。首先在大肠杆菌中建立了异戊二烯生产体系,挑选肺炎链球菌来源的IDI进行蛋白质建模和结构分析,计算得到了活性热点Met146并对其进行点突变。经过改造得到1株突变体Met146His,其将异戊二烯的产量提升至820.46 mg/L。接着针对该突变株进行启动子优化和RBS优化,最终得到的优化菌株将异戊二烯的产量提升至862.79 mg/L,是出发菌株的2.58倍。结果证明,对于IDI进行酶分子改造和表达优化以提高酶活性并调控表达水平,是提高异戊二烯产量的有效策略。IDI的优化也可以应用于异戊二烯的下游产物,如倍半萜和二萜等的生物合成。

基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

基于非靶向代谢组学分析谷氨酸棒杆菌分泌表达外源蛋白代谢差异

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)由于其无内毒素以及有完善的分泌系统可用于分泌生产重组医药蛋白,被认为是很有潜力的外源蛋白表达宿主。外源蛋白分泌表达涉及蛋白合成、运输以及分泌等多个耗能过程,能量代谢的扰动引起宿主细胞整体代谢水平的变化。该研究以C.glutamicum CGMCC1.15647菌株为研究对象,利用非靶向代谢组学比较分泌表达外源蛋白对菌株自身代谢的影响,发现在分泌表达外源蛋白组中共有176个差异代谢物,其中79个代谢物显著上调表达,97个代谢物显著下调表达,关键代谢物为D-甘露糖-6-磷酸、叶酸、肌苷、L-色氨酸、L-苯丙氨酸等。差异代谢物通路分析表示,分泌表达外源蛋白会导致中心代谢加剧和多种氨基酸特别是芳香族氨基酸代谢的变化,以满足蛋白合成和分泌对能量的需求,同时保护胞内蛋白以维持菌体正常生长。该文从代谢水平上探究C.glutamicum CGMCC1.15647分泌外源蛋白过程中的关键代谢物及代谢调控网络,对于优化C.glutamicum细胞中代谢流使之趋向于有利于蛋白分泌表达有重要的研究意义。

依赖IL-5增殖的细胞株TF-1-9E3的驯化及验证

在IL-5靶点药物的发现阶段,为评价候选药物的阻断活性,需建立依赖IL-5增殖且信噪比高、重现性好的检测用细胞株。TF-1是人白血病细胞,其生长完全依赖IL-3或GM-CSF,而IL-5与IL-3和GM-CSF共用β(βc)受体,因此,研究以GM-CSF依赖的TF-1细胞株为来源,用IL-5替换TF-1细胞生长必需的生长因子GM-CSF,降低血清含量进行细胞驯化培养传代。通过35 d的细胞驯化及3~5次降血清传代培养,采用有限稀释法分离单克隆,一共得到14个单克隆细胞株。对14株细胞进行FACS检测,其中,有9个细胞株IL-5Rα表达量升高。对IL-5Rα过表达的细胞株进行IL-5增殖检测,结果表明,相比8%FBS得到的单克隆,6%FBS得到的单克隆对IL-5刺激更敏感。通过单因素优化实验,细胞增殖检测最优的细胞接种量为2×10^(4)个/孔,FBS含量为3%,血清品牌为Gibco。驯化后的细胞TF-1-9E3对IL-5的剂量-效应曲线的信噪比为3.19,Emax区间为2.15,可用于IL-5的生物学活性检测及IL-5与IL-5Rα的抗体阻断活性检测。

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^(K229L)和ARO5,分支酸变位酶ARO7^(G141S)和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。

毕赤酵母甲酸脱氢酶辅因子特异性改造及应用

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH,EC 1.2.1.2)在发酵工业中常被应用于酶法辅因子再生系统。为了改造巴斯德毕赤酵母甲酸脱氢酶(FDH from Komagataella phaffii,Kph FDH)的辅因子特异性并应用于体外NADPH辅因子再生系统,研究基于多序列比对和文献调研的结果,确定了D195、Y196为突变位点,构建了16个突变体,并表征了野生型和突变体的比酶活力和酶促反应动力学。得到最优的NADP+特异性突变体为Kph FDH D195Q/Y196R,其对NADP+的催化效率(k_(cat)/K_(m))为1.967 L/(mmol·s),催化特异性比率[(k_(cat)/K_(m)NADP+)/(k_(cat)/K_(m)NAD+)]为36.426;以NADP+作为辅因子时,对甲酸的催化效率(k_(cat)/K_(m))为0.020 L/(mmol·s)。最后成功将该突变体应用于苯丙酮酸还原胺化反应中的NADPH再生,200 min内几乎完全反应。该研究填补了毕赤酵母FDH辅因子特异性改造方面的研究空白,为发酵工业中NADPH辅因子再生系统应用提供了一种工具酶,同时也为进一步改造该酶的辅因子特异性提供了一种出发突变体。

谷氨酸棒杆菌细胞工厂育种策略以及高通量筛选技术的研究进展

谷氨酸棒杆菌作为工业生产氨基酸及众多高附加值产品的工程菌株,是一种绿色高效的底盘微生物,已被开发为工业微生物细胞工厂。设计与构建高效工业微生物细胞工厂是绿色生物制造的重要基础,也是促进实现“碳中和”目标的重要途径之一。微生物育种及高通量筛选技术是创制高效微生物细胞工厂和生物产业技术创新的重要方向。文章结合实际案例针对谷氨酸棒杆菌细胞工厂的育种策略和高通量筛选技术进行综述,以期为谷氨酸棒杆菌选育领域的相关研究提供参考和借鉴。

生物过程工程研究在创新生物医药开发中应用的驱动力--生物反应器

近年创新生物医药在生物产业中的比重逐渐增大,也给生物产业带来了巨大的经济效益,靶点筛选及分子构建等上游技术的进步是促进生物医药进步的主要原因。随着目前细胞培养技术在生物医药生产中的广泛应用,对细胞培养技术的要求也不断提高,同时细胞培养技术的实现载体——生物反应器的技术改进和创新也越发凸显其重要性。本文介绍了生物反应器在创新生物医药产业中的应用种类、发展趋势及发展驱动力,回顾了全球范围内新型生物反应器的发展成果,包括新型反应器技术及过程分析技术在生物医药中的应用,最后,分析了中国生物反应器的发展现状与问题,指出了生物反应器的发展与进步应以提高生物培养过程的稳定性最终提高产品的质量而不是以提高产量为主要目标。本文详细阐述现代生物反应器技术及基于"质量源于设计"的质量控制理念在其中所起到的关键作用,以及生物反应器的技术发展的现状和未来走向。

普鲁兰酶突变体文库高通量筛选方法的建立及应用

在摇瓶水平实现普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)在大肠杆菌BL21(DE3)的异源表达,并成功按规格缩小实现了基于深孔板的高通量细胞培养,同时建立了基于深孔板的普鲁兰酶酶活快速高效的高通量检测方法。利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化,突变基因产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其表达量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。

转录因子FOXA1在乳腺癌分子分型中的功能研究

乳腺癌作为高度异源性的疾病,其准确的分子分型对于乳腺癌预后判断和制定合理的治疗方案都具有十分重要的临床意义。通过前期生物信息学分析认为foxa1在乳腺癌中具有重要的分子分型作用,利用免疫印迹法及实时定量PCR方法在涵盖4个乳腺癌亚型的10个乳腺癌细胞株中检测FOXA1的mRNA及蛋白表达水平情况,探索其与乳腺癌分子亚型之间关联,以及在肿瘤发生、发展及预后中的意义。结果显示,FOXA1的mRNA和蛋白表达量在乳腺癌Luminal A型和Luminal B型中显著高于其在Her2过表达型和三阴性型乳腺癌细胞株中的表达量。通过对其他促进细胞生长的重要基因表达量的关联分析以及基因沉默实验,发现FOXA1是介于GATA3和ER的关键调控元素,其高表达能够抑制细胞增殖。研究提出foxa1可以作为辅助分子对乳腺癌进行精准分型,验证了前期的生物信息学结论,推动了乳腺癌精准医学的发展。

外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析

以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析,利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析,继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers),最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物;通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象,即糖酵解增强,TCA溢流,回补途径增加,乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据,为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。

不同表达模式组合对谷氨酸棒状杆菌中脑钠肽蛋白表达的影响

外源蛋白表达系统按照启动子作用方式可分为诱导型和组成型,按照蛋白表达后的定位可分为胞内表达和分泌表达。为了研究外源蛋白在谷氨酸棒状杆菌中最适的表达模式组合,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为模式蛋白构建用于研究谷氨酸棒状杆菌不同表达模式的快速表达体系,并利用这一体系研究脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)的最适表达模式。结果表明,相比于诱导型胞内表达、诱导型分泌表达、组成型分泌表达模式,BNP通过组成型胞内表达可达到最高的表达量。表达产物经过NI-NTA亲和层析,可得到纯化的BNP产量为235.5 mg/L,纯度可达90%。该研究构建了一套谷氨酸棒状杆菌中外源蛋白不同表达模式组合的快速检测方法,并成功实现了BNP的表达,这对以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达外源蛋白具有重要的指导意义。