爱普锐克吞食片对犬细粒棘球绦虫驱除试验

观察爱普锐克吞食片(每片含吡喹酮100mg)对犬细粒棘球绦虫驱除效果。将人工感染细粒棘球绦虫实验犬分设5组,Ⅰ组试验药品2.5mg/kg,Ⅱ组试验药品5mg/kg,Ⅲ组试验药品7.5mg/kg,Ⅳ组对照药品5mg/kg,Ⅴ组空白对照。投药后72h剖解试验犬,检查各组荷虫情况。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组粗计驱虫率均为100%。5mg/kg推荐剂量可成为犬细粒棘球绦虫成熟期前驱除的有效剂量。

爱普瑞克驱杀绵羊痒螨和寄生线虫的疗效观察

对自然感染寄生线虫和痒螨的绵羊用爱普瑞克制剂进行驱杀疗效观察。通过虫卵和痒螨检查确定阳性羊，设爱普瑞克0．05、0．1、0．2mg／kg体重3个剂量组，同时设阿维菌素0．2mg／kg体重和空白对照组，经羊皮下注射药物。结果表明，爱普瑞克按0．2mg／kg体重和阿维菌素0．2mg／kg体重驱杀绵羊痒螨杀净率均达100％，寄生线虫虫卵转阴率、卵减率都达100％。而爱普瑞克0．05mg／kg体重，0．1mg／kg体重驱治效果差，螨虫杀净率为53％～80％，且用药后第20天痒螨病复发；寄生线虫虫卵转阴率、卵减率只有30％～80％。0．2mg／kg体重为爱普瑞克驱杀绵羊寄生线虫和瘁螨最低有效剂量。

浅谈高床舍饲养羊寄生虫病防治

为了解新疆南疆部分地区高床舍饲养羊寄生虫的感染状况,通过自制寄生虫病调查表及羊粪样实验室检查结果的新疆统计分析,表明南疆高床舍饲养羊寄生虫存在不同程度的感染,说明寄生虫病影响着舍饲养羊业的健康发展,本文就如何发展和推广高床舍饲养羊提出具体措施,对提高舍饲养羊的经济效益具有一定的指导意义。

5%AVM预防绵羊疥癣病的长效试验

目的检测5%AVM对绵羊疥癣病的预防效果。方法通过痒螨检查确定试验羊,设Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ5%AVM三个剂量组,Ⅳ为1%阿维菌素注射液组,Ⅴ为螨净组,Ⅵ为空白对照组,每个组7只试验羊;Ⅶ为传染源组。按羊的体重皮下注射或药浴,观察近90d。结果Ⅰ组61d发病;Ⅱ、Ⅲ组92d发病;Ⅳ组35d发病;Ⅴ组没有发病;Ⅵ组21d发病。结论5%AVM有效预防绵羊疥癣病近90d。

以家犬驱虫为中心的棘球蚴病控制措施在新疆两县的应用

目的通过新疆呼图壁县和温宿县区域试验,验证以家犬(包括牧犬)驱虫为中心的棘球蚴病控制措施的可行性和控制效果。方法1987-1990年在新疆呼图壁县和1990-1994年在新疆温宿县分别建立棘球蚴病控制试验区,采用消灭病原以阻断循环链的控制策略,即"犬犬驱虫、月月投药"的措施,对试验区所有家犬用吡喹酮药饵剂型进行预防性驱虫。实施控制措施后,每年在试验区检测犬的细粒棘球绦虫和绵羊的棘球蚴感染率,以评价驱虫效果。结果经过连续3￣4年实施"犬犬驱虫、月月投药"措施,呼图壁县和温宿县的家犬细粒棘球绦虫平均感染率分别从实施前的18.5%和14.7%降为0;两县新生绵羊的棘球蚴平均感染率比控制模式实施前降低了85%以上。结论以家犬驱虫为中心的策略,即"犬犬驱虫,月月投药"的措施对控制家犬的棘球绦虫病和绵羊的棘球蚴病是有效可行的。

绵羊包虫病基因工程疫苗(Eg95)免疫试验

目的验证绵羊包虫病基因工程疫苗(Eg95)对新疆羊源棘球蚴病预防效果。方法应用新西兰农牧科学院沃勒斯维尔动物研究中心提供的绵羊包虫病基因工程疫苗(Eg95),对新生新疆细毛羊、巴音布鲁克羊、山羊羔羊进行二免、三免、四免,以间接ELISA法作血清抗体动态检测,在免疫42d、180d、365d、730d进行人工感染,于感染后180d剖解试验羊;试验羊二免后在包虫病的高发区放牧饲养180d、365d730d后剖解试验羊,检查免疫组与对照组羊的肝脏和肺脏荷囊数量,统计保护率(减囊率)。结果1.Eg95有体征反应,属于正常疫苗反应;2.免疫组与对照组血清IgG的OD值之比?2;3.二免后42d,人工感染的保护率:新疆细毛羊90.5%,山羊100%;4.二免后180d,人工感染的保护率:新疆细毛羊94.6%,山羊82.2%;自然感染的保护率:新疆细毛羊88.1%,巴音布鲁克羊83.6%。5.二免后365d,人工感染的保护率:新疆细毛羊97.4%;自然感染的保护率:新疆细毛羊83.6%,巴音布鲁克羊83.3%。6.二免后730d,人工感染的保护率:新疆细毛羊86.%;自然感染的保护率:87.1%;7.三免后180d,人工感染的保护率:新疆细毛羊99.2%。8.三免后365d,人工感染的保护率:新疆细毛羊95.6%,自然感染的保护率95.1%。9.四免后365d,人工感染的保护率:新疆细毛羊97.7%,自然感染的保护率95.5%。结论Eg95对新疆羊源棘球蚴病具有预防作用,免疫程序为新生羊羔初次2次,间隔期1个月(或4周),其后每年加强一次。

多头绦虫膜蛋白(45M)对羊脑多头蚴病的免疫保护效果

目的观察多头绦虫膜蛋白(45M)对羊脑多头蚴病的免疫保护效果。方法12只新疆哈萨克羊随机均分为免疫组和对照组,免疫组用重组多头绦虫膜蛋白(45M)与佐剂乳化后颈部皮下2点免疫,抗原免疫剂量为50μg/只,注射体积为1ml,共免疫4次,每次间隔3周。对照组以谷胱甘肽硫转移酶(GST)表达物代替免疫抗原同法免疫。定时采集羊血,分离血清。ELISA法检测血清中IgG和IgM的抗体水平。于末次免疫后105d,免疫组和对照组每羊经口攻击感染5000个多头绦虫虫卵,感染2周后剖检羊脑多头蚴囊数,计算减囊率。将经孵化激活的六钩蚴分别置于含10%两组免疫攻击感染羊血清的RPMI1640培养液中培养,观察两组羊血清对多头绦虫六钩蚴的杀伤情况。结果免疫组有3只羊感染多头蚴包囊,平均囊荷数为1.5个,囊平均直径为2.2mm,免疫组减囊率为68.9%。六钩蚴与免疫组羊血清共培养72h后,90%死亡,被杀伤的六钩蚴出现萎缩,或膨胀致使内部结构模糊。ELISA检测结果显示,在第4次免疫后(第9周),免疫组IgG抗体水平达到最高(2.32±0.76),与对照组(0.70±0.42)间的差异有统计学意义(t=4.47,P<0.01)。经口感染六钩蚴后(第24周),免疫组IgG和IgM抗体水平(1.53±0.81,0.90±0.26)仍显著高于对照组(0.64±0.43,0.43±0.15)(P<0.01)。结论重组蛋白45M可引起机体较强的体液免疫反应。

犬细粒棘球绦虫粪抗原夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性和敏感性高的检验犬细粒棘球绦虫感染的方法。用细粒棘球绦虫(简称,Eg)成虫抗原分别免疫兔和绵羊,收集高免血清,纯化的高免抗体。依据抗体夹心ELISA工作原理,以兔抗体包被,检测感染Eg、不同犬带科绦虫的实验犬和空白犬粪样,绵羊抗体扑捉抗原,HRP标记兔抗绵羊IgG(1∶8 000)催化显色,用酶标仪测定OD 405nm吸光度,用以确定其特异性和敏感性。试验结果表明,敏感性为82.69%(43/52),特异性为85.88%(140/163);粪抗原在感染细粒棘球绦虫16d后可检出,最低抗原浓度为9.7ng/mL即犬感染5条成虫时可检测出阳性。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,为进一步研制检测细粒棘球绦虫虫体抗原ELISA检测试剂盒奠定了基础。

EgM9免疫犬产生抗体变化规律的观察

目的用重组表达蛋白EgM9免疫实验犬,观察免疫犬的抗体变化及EgM9的免疫效果。方法用100μgEgM9及5mg的GST并辅以佐剂QuilA分别免疫实验犬,定期收集血清,以间接ELISA法检测血清中IgG及其亚类、IgM、IgA与IgE;感染45d后剖检实验犬,统计犬体内虫体数量。结果免疫组和对照组血清IgG与IgA差异显著(P<0.05);而IgG1与IgG2免疫组和对照组差异极显著(P<0.01);IgM与IgE免疫组和对照组无显著差异(P>0.05);相对于对照组,免疫组的保护率达86%。结论用重组蛋白EgM9免疫犬后能产生很高的抗体水平,可以抑制细粒棘球绦虫的发育,EgM9或许有望作为一种有效的候选疫苗成分用于包虫病的防治。

多头蚴病保护性基因的分离与表达

目的分离与表达多头绦虫（Taenia multiceps）基因45m，确定其免疫原性及在虫体不同发育阶段的表达。方法通过对绦虫同源基因序列分析设计引物，运用RT—PCR的方法，首次从绵羊多头绦虫的幼虫阶段分离到新的基因45m，将其克隆到pET41b表达载体中，获得了含正确读码框的重组质粒，将表达蛋白初步运用于动物免疫试验。结果45m基因长度为698bp，编码232个氨基酸。表达的重组蛋白分子量约为63kD，表达产量可达100～120mg／L。其蛋白序列与已知抗羊带绦虫（45W）和牛带绦虫保护性抗原的同源性分别为89％和85％。本动物绵羊的免疫接种试验表明该蛋白可有效激起机体的抗原抗体反应，其抗血清可以与多头绦虫的成虫和幼虫抗原总蛋白在63kD处发生特异性反应。结论45m蛋白可能具有较强抗原性，该蛋白在虫体的成虫和幼虫阶段均有表达，推测认为45m可能成为多头蚴病的候选疫苗。

用抗虫体表膜抗原抗体测定犬细粒棘球绦虫粪抗原

利用Echinococcus granulosus(Eg)成虫表膜抗原抗体夹心ELISA方法检测犬细粒棘球绦虫感染的粪抗原。首先提取E g成虫表膜抗原,制备抗E g成虫表膜抗原的血清,然后用间接ELISA和Western blotting方法检测其抗原抗体反应及免疫原性,用间接免疫组化方法对E g成虫表膜蛋白进行组织定位。利用双抗体夹心ELISA方法检测感染E g的犬粪抗原。ELISA结果表明E g成虫表膜抗原具有良好的抗原性并能产生高效价抗体,抗体不与多头绦虫和泡状带绦虫抗原反应;Western blotting结果表明E g成虫表膜抗原与原头蚴、不成熟E g有共同蛋白成分。免疫组化结果证实虫体表膜蛋白分布在虫体表皮。该抗原抗体系统能检测到感染后13d的犬细粒棘球绦虫。结果表明该E g成虫表膜抗原抗体系统可用于诊断犬细粒棘球绦虫感染。

绵羊脑多头蚴病45m基因在多头绦虫和细粒棘球绦虫不同发育阶段同源性的比较

目的研究绵羊多头蚴病45 M重组蛋白的同源性。方法将多头蚴的45 m基因片段亚克隆到pET41b表达质粒,构建45 m-pET41b原核表达系统,诱导表达45 M重组蛋白,制备小鼠高免血清,进行免疫印迹试验(Western blot);运用RT-PCR的方法,从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45 mA。结果45 M蛋白的高免血清可被细粒棘球绦虫不同发育阶段的天然抗原所识别,均在63kD处发生交叉反应;从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45 m基因的同源基因,命名为45 mA(Gen-Bank号为EU326106),45 m和45 mA的核酸序列和蛋白序列分别有86%和76%的同源性;45 M和45 MA蛋白与细粒棘球蚴的保护性蛋白Eg95有57%的氨基酸同源性。结论提示45 m抗原分子在多头绦虫和细粒棘球绦虫的不同发育阶段均存在,为45 M蛋白的免疫原性的分析提供了宝贵的资料。

2012年新疆蓝舌病血清学调查及区间分布

为了解2012年新疆地区蓝舌病（BT）流行现状，本研究采用免疫凝胶扩散实验对采自新疆8个地（州市）8个县市的2142份牛羊血清进行BT血清学调查。检测结果表明：调查地区的羊普遍存在BTV感染，感染率存在区间差异；羊血清感染率在0．51％～3．33％之间，平均阳性率为1．32％；牛血清中未检测出阳性。通过对2012年新疆BT流行区域分布与气候等自然因素之间的相关性分析发现：新疆BT感染率与地理位置有一定的相关性，就全疆而言，南疆蓝舌病血清学阳性率高于北疆，BTv感染率与年平均气温显著相关，与年平均降雨量有负相关性，由此可见，地理位置和气候对BT流行病学影响较大。

细粒棘球蚴-原头蚴体外培养成囊模型的建立

建立原头蚴体外成囊发育的技术方法,为包虫病研究提供实验材料。在CO2培养箱中37℃条件下,单相培养体系中体外培养原头蚴,并用显微镜定期观察其大小及形态变化。结果发现:第10天原头蚴开始向囊发育;在第35～40天出现肉眼可见的囊,存活时间达100 d,最大囊可达2 mm,原头蚴成囊率达90%。

多房棘球绦虫—泡球蚴的体外培养研究

按照多房棘球绦虫幼虫-泡球蚴培养的培养基(RPMI-1640、M199和MEM)分为3组:Ⅰ组为含10%胎牛血清的RPMI-1640;Ⅱ组为含10%胎牛血清的MEM;Ⅲ组为含10%胎牛血清的M199。将泡球蚴在3种细胞培养液中进行培养,观察其存活、生长以及发育情况。结果显示,培养9 d的泡球蚴的成活率分别为:Ⅰ组90.10%、Ⅱ组50.25%、Ⅲ组22.03%;成囊率分别为:Ⅰ组57.12%、Ⅱ组63.15%、Ⅲ组48.17%;头节外翻率分别为:Ⅰ组98.28%、Ⅱ组88.65%、Ⅲ组75.50%。可见,大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对多房棘球绦虫泡球蚴的体外培养,初步表明含有10%小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合泡球蚴的生长发育,为研究寄生虫发育提供了最基本的数据资料。

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时,以0.3 mmol.L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg.L-1。Western blotting检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。

细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性分析

【目的】探索细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性。【方法】细粒棘球绦虫成虫虫体冻融产物,经蛋白酶K消化,离心上清作为粗提表膜糖抗原,SDS-PAGE鉴定糖抗原成分,硫酸-蒽酮法测定多糖浓度,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测免疫小鼠抗血清抗体效价和特异性以及确定抗原在虫体组织中的位置。【结果】SDS-PAGE图谱显示无蛋白条带出现,表明成虫膜蛋白被蛋白酶K完全降解;制备的糖抗原浓度为2.54mg.mL-1,初步确定为糖抗原。ELISA结果显示,随着免疫次数增加,抗血清中特异性抗体(IgG、IgM和IgA)效价也随之升高。与阴性血清相比,IgG、IgM和IgA的P/N值分别为4.9、3.2和6.4。未检测到特异性IgE。Wenstern-blot检测结果显示,抗血清与原头蚴粗提虫体蛋白、细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白、表膜糖抗原有效识别。IFA显色结果显示糖抗原在细粒棘球绦虫虫体表膜中有表达。【结论】经蛋白酶K消化后提取的细粒棘球绦虫表膜糖抗原具有良好的的免疫原性和免疫反应性,有望用于包虫病的诊断和免疫。

监测重组蛋白EgM9免疫犬的特异性抗体变化

【目的】探索EgM家族重组蛋白(EgM9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律。【方法】利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgGI、gG1I、gG2、IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证。【结果】经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1I、gG2,差异极显著(P<0.01),而特异性抗体IgAI、gM和IgE差异不显著(P>0.05)。【结论】证实EgM家族重组蛋白(EgM9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答。

细粒棘球蚴原头蚴包囊和原头蚴成虫抑制差减杂交文库中差异表达基因的筛选及分析

细粒棘球绦虫原头蚴(PSC)具有双向发育的特点,本文旨在利用SSH和生物信息学方法筛选原头蚴包囊(CW)和成虫(AW)特异性的基因。将PSC-CW和PSC-AW双相发育差减cDNA文库的差减PCR产物克隆入pGEM-T载体并测序,利用CAP3sequence assembly在线软件、Blast2GO软件与GenBank数据库对测序结果进行分析,筛选原头蚴成囊和成虫特异性的基因,并探讨这些基因的功能。结果显示:对PSC-CW和PSC-AW文库进行扩增,分别得到280和200个阳性克隆,菌落PCR鉴定结果表明,这些克隆均插入200~1 000bp片段。测序结果显示从PSC-CW和PSC-AW SSH文库中分别得到16和10个特异性基因。其中PSC-CW SSH文库中得到4个出现频率较高的基因,其余12个基因仅出现1次,其中5个为未知基因,已知基因分别编码细胞色素C氧化酶Ⅰ、热休克蛋白70和铁蛋白等功能蛋白质。PSC-AW SSH文库中得到10个基因,其中2个出现频率较高基因,8个基因仅出现1次,4个为未知基因,6个已知基因分别编码基质蛋白1、延伸因子1α和脂肪酸结合蛋白等功能蛋白质。本研究筛选获得原头蚴成囊和成虫发育时差异表达的基因,对这些基因的功能进行分析表明,PSC-CW SSH文库中多是与营养和能量转运功能的相关基因,而PSC-AW SSH文库中多为发育与分化相关的基因,这些基因的差异表达可能与原头蚴处于不同的生长环境和发育方向有关,同时也为棘球蚴病免疫诊断、药物筛选和疫苗研制提供候选基因。

四种宠物鼠作为多房棘球绦虫的中间宿主的研究

用多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)原头蚴继发感染一线仓鼠(坎培尔仓鼠Dwarf Campbells RussianHamster)、冬白仓鼠(倭仓鼠Phodopus sungoris sungoris)、金丝熊仓鼠(黄金鼠Mesocricetus auratus)、松鼠(Sciurusvulgaris)4种宠物鼠各4只。接种70 d后剖解各种宠物鼠1只,一线仓鼠、金丝熊仓鼠、松鼠未发现包囊泡,冬白仓鼠分离出包囊泡4.37 g,占体重的7.23%;接种95 d后4种宠物鼠的平均湿包囊泡重和包囊泡重占体重的百分比分别为:冬白仓鼠13.05g和33.03%,金丝熊仓鼠2.22 g和1.98%,松鼠2.28 g和3.54%,冬白仓鼠、金丝熊仓鼠和松鼠都出现成熟原头蚴,一线仓鼠未发现包囊泡。试验证明冬白仓鼠、金丝熊仓鼠和松鼠对多房棘球绦虫原头蚴较敏感,可以作为Em的中间宿主。