实时定量PCR应用于研讨式分组实验教学实践

实时定量PCR作为一项生命科学及其相关领域的重要技术,已成为高校生物实验教学中不可或缺的知识内容。以分子生物学实验基础教学内容为依托,围绕实时定量PCR技术面向本科生开设了综合性实验。在充分考虑学生的理论和操作水平以及本科实验教学特点的基础上,对实验设计和实验方法进行了优化,并采取研讨式分组教学模式,提高教学效率与教学质量的同时,更突出了学生在实验教学中的主体地位,有助于培养学生的科学思维、科学素养以及综合实践能力。

大型仪器应用于本科开放性实验教学的探索与实践——以高效液相色谱仪为例

大型仪器对于创新人才的培养具有不可替代的积极作用。如何使本科教学大型仪器在人才培养中发挥更大的作用,需要依据仪器自身特点,采取合适的教学方式,方能达到事半功倍的效果。以生物技术专业的“基于高效液相色谱仪的开放性实验项目”为例,探讨以开放探究性实验项目为载体的大型仪器实验教学模式。从项目实施的基础、实施过程、结题和答辩等方面介绍了该模式的全过程。实践表明,该模式不仅能够使学生熟练掌握大型仪器的使用,还能培养学生的科研能力,值得推广。

本科生基本实验技能竞赛的实践与启示

南开大学生物国家级实验教学示范中心针对每门基础实验课程为修课学生组织了基本实验技能竞赛,通过做好前期宣传工作、完善竞赛流程和管理制度以及建立健全师生激励机制等措施,大大提高了学生对基础实验课程的重视程度,突出了基本实验技能的重要性,有利于教师根据竞赛反馈,强化优势,弥补不足,不断提升本科实验教学质量,积极推进实验教学改革。与此同时,生物国家级实验教学示范中心多年来还面向天津市高校组织了数届“大学生生命科学基本实验技能竞赛”,在提高人才培养质量,促进兄弟院校间的经验分享与协同创新等方面发挥了重要的示范和辐射作用。

良性前列腺增生组织中基质细胞的增殖和凋亡

目的:探讨良性前列腺基质增生组织中细胞增殖及凋亡状态的改变。方法:采用双抗体免疫组化方法,对6例良性前列腺增生和4例正常前列腺组织标本中平滑肌细胞的增殖状态进行研究;采用免疫组化和TUNEL相结合的方法,在连续的组织切片上观察基质细胞凋亡状态的变化。结果:在增生的前列腺组织中,处于增殖状态的平滑肌细胞比例远远高于正常前列腺组织,处于凋亡状态的基质细胞比例低于正常前列腺组织。结论:良性前列腺增生组织中,平滑肌细胞的增殖增加和基质细胞的凋亡减少同时发生。

一株引起普通棉耳狨猴死亡病毒的分离与鉴定

1999年6月,天津医科大学动物中心饲养的珍贵灵长类实验动物——普通棉耳狨猴群体中暴发急性呼吸道传染病,病死率高达33％。在排除细菌感染的基础上,通过死亡狨猴肺组织匀浆接种鸡胚和MDCK细胞的分离培养,分离出一株具有高血凝效价的病毒株。经双份血清试验及动物接种试验,确认该病毒是本次疾病流行的病原体。又进一步通过与常见呼吸道病毒标准毒株及血清进行交叉血凝抑制试验、电镜观察、RT-PCR技术并结合生物信息学方法对该毒株进行鉴定,确认本次疾病流行的病原体是副流感1型病毒中的仙台病毒。

2型糖尿病患者胰岛素受体酪氨酸激酶域基因突变研究

目的探讨胰岛素受体（ＩＮＳＲ）基因变异与２型糖尿病发病的关系。方法采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法对１０７例２ 型糖尿病患者ＩＮＳＲ酪氨酸激酶（ＩＲＴＫ）域基因（ＩＮＳＲ基因ｅｘｏｎ １７～２１）进行突变筛查，并进一步测序确证。结果检测出１３例ｅｘｏｎ １７静止突变；１例ｅｘｏｎ ２０突变，测序确证为ｃｏｄｅｎ １１９１ ＧＡＣ→ＡＡＣ突变，Ａｄｐ被Ａｓｎ代替。结论ＩＲＴＫ域有义突变在中国人２型糖尿病中出现频率较低。Ａｓｐ１１９１→Ａｓｎ变异对ＩＲＴＫ活性的影响及其在２型糖尿病发病 中的作用尚待进一步研究。

一株感染普通棉耳狨猴的呼吸道病毒的RT-PCR鉴定

目的 :鉴定一株在普通棉耳狨猴(CallithrixJacchus)群体中引起急性呼吸道感染并引起大批狨猴死亡的病毒。方法 :根据几种可能的呼吸道病毒的保守基因序列设计合成引物 ,用RT -PCR方法对分离到的病毒进行鉴定。结果 :唯有仙台病毒的引物能够扩增出PCR产物 ,且与预期扩增片段大小一致。结论 :本次狨猴群体中流行的病原体是一株仙台病毒 (sendaivirus)。

原核表达GST-GAPDH蛋白的快速斑点印渍检测

western blot是生命科学研究中分析特定蛋白质的常用手段。在分子生物学实验课程已经建立的克隆小鼠GAPDH基因编码序列教学过程的基础上,以IPTG诱导后的原核细胞裂解液为实验材料,建立了适合课题教学的快速斑点印渍检测方法,使学生能够很好地掌握western blot的实验原理和方法;直观地观察到自己整个分子克隆实验的成果,激发了学生的学习兴趣,促进了学生的科学研究能力的提升。

普通棉耳狨猴中乙型流感病毒的分离和鉴定

乙型流感病毒是引起人类局部流行性感冒的重要病原体 ,其起源和自然储存宿主目前仍不清楚 .1 999年夏季在某动物中心饲养的普通棉耳狨猴 ( Callithrix jacchus)群体中爆发了以呼吸道症状为主的急性传染病 ,死亡比率高达 1 /3.通过对死亡狨猴肺组织匀浆接种鸡胚和 MDCK细胞的分离培养 ,分离出病毒 .双份血清的红细胞凝集抑制试验证实 ,此分离株为此次狨猴群体感染流行的病原体 .通过甲型和乙型流感病毒标准血清鉴定 ,证实该分离株为乙型流感病毒 ,命名为 B/marmoset/China/1

基质金属蛋白酶及其组织抑制因子在人前列腺组织及各种类型前列腺细胞中的表达

目的:研究基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子(TIMPs)在人前列腺组织及各种类型细胞中的表达。方法:用半定量RT-PCR的方法,对癌变和非癌变部分的前列腺组织、原代培养的平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞以及4种前列腺上皮细胞系(BPH-1、LNCaP、DU-145和PC-3)中MMP2、MMP7和MMP9、膜型基质金属蛋白酶1和3(MT1-MMP和MT3-MMP)及其组织抑制因子1和2(TIMP-1和TIMP-2)的mRNA水平进行了测定。结果:MMP-2主要在前列腺基质细胞中表达;MMP-7和MMP-9则在前列腺上皮细胞中有较高的表达;MT1-MMP、MT3-MMP、TIMP-1和TIMP-2在前列腺基质细胞和上皮细胞中均有表达,但MT1-MMP和MT3-MMP在成纤维细胞中的表达量较高;另外,各种基质金属蛋白酶及其组织抑制因子在各种前列腺细胞系中也存在差异表达。结论:MMPs和TIMPs在前列腺组织及其各种类型细胞中的差异表达提示:它们可能在前列腺癌的转移中起着不同的作用。

阿特拉津降解菌株的分离和鉴定

从农药厂废水中分离到６株能以除草剂阿特拉津为唯一氮源生长的细菌，即假单胞菌（Ｐｓｅｕ－ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）ＡＤ１、ＡＤ２和 ＡＤ６，土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＤ４，黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＤＳ，欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）ＡＤ７。ＡＤ１菌株能使无机盐培养基中的 ０．３ｇ／Ｌ阿特拉津在７２ｈ内降解９９，９％。当以ＡＤ１、ＡＤ２、ＡＤ４、ＡＤ５、ＡＤ６和ＡＤ７菌株的总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增时，除ＡＤ２菌株以外，均得到了与文献报道的假单胞菌ＡＤＰ菌株的阿特拉津氯水解酶基因（ａｔｚＡ）同源的ＰＣＲ产物。

基于拔尖人才培养的基础实验课研讨式教学探索与实践

生物伯苓班是南开大学入选的“国家基础学科拔尖人才培养计划”生物学科人才培养试点班.为满足低年级伯苓班同学进入科研实验室开展科学研究的需要,将国内外普遍推崇的研讨式教学应用于生物化学实验教学.在为学生提供系统性学科知识学习和基本实验技能训练的同时,开展基于科研的探究性实验课题研究,培养学生科研能力,激发创新意识.教学实践表明,经研讨式学习的历练,学生科研能力得到很大提高,该教学模式受到学生的高度评价和认同.

癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞TGF-β1和Smoothelin基因表达的影响

目的:研究中药癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞TGF-β1和Smoothelin基因表达的影响。方法:把含癃必消胶囊的药物血清加入到体外培养的人前列腺增生间质细胞中,采用实时定量RT-PCR检测TGF-β1和Smoothelin在体外培养的人前列腺增生间质细胞中的表达。结果:高、低中药浓度血清对TGF-β1的相对表达CT值分别为0.158±0.020、0.169±0.020,较对照组显著降低(P<0.01);高、低中药浓度血清对Smoothelin的相对表达值分别为0.035±0.007、0.036±0.007,较对照组显著降低(P<0.01)。结论:癃必消胶囊可能通过抑制前列腺间质细胞TGF-β1和Smoothelin基因的表达达到治疗前列腺增生的目的。

加强实验室建设 提高分子生物学实验教学质量

实验教学是高校实践型创新人才培养的重要途径,而实验室又承担着实验教学的重任,因此,加强实验室建设是提升实验教学水平和高校人才培养的必然要求。生物化学与分子生物学实验室为提高分子生物学实验课程的教学质量,在实验室试剂耗材条件、设备资源配置和实验环境安全建设上进行了不懈探究和努力实践,在推进实验教学改革和建立安全实验环境等方面取得了良好的效果。

TGFβ1介导雌二醇对前列腺间质细胞smoothelin表达的促进作用

研究了雌激素在促进前列腺基质细胞化过程中作用的分子机制,在前列腺基质细胞培养液中分别添加 TGFβ1,雌二醇、雌二醇和 ICI182.780、睾酮、睾酮和芳香化酶抑制剂、双氢睾酮、雌二醇和 TGFβ1中和抗体;用半定量 RT-PCR 的方法检测基质细胞中平滑肌细胞特异蛋白 smoothelin 和 TGFβl mRNA 的表达水平;用ELISA 测定基质细胞培养基中 TGFβ1的浓度.结果显示 TGFβ1可明显促进 smoothelin 的表达;雌二醇和睾酮能明显刺激 TGFβ1基因和蛋白的表达水平,而雌激素受体抑制剂 ICI182.780和芳香化酶抑制剂可分别抑制雌二醇和睾酮对 TGFβ1表达的促进作用;双氢睾酮对 TGFβ1基因的表达没有影响.TGFβ1中和抗体能抑制雌二醇对 smoothelin 的促表达作用.结果显示雌二醇可能通过诱导 TGFβ1促进前列腺平滑肌细胞特异蛋白smoothelin 的表达.

蛋白质免疫印迹技术在本科实验教学中的应用

蛋白质免疫印迹技术是生命科学研究领域的常用技术手段,尝试将其改造成适于本科教学实践的实验内容,即在基础性分子生物学实验的基础上开设"免疫印迹法检测目的基因在原核细胞中的表达"这一综合性实验。根据学生的理论和操作水平以及本科实验教学特点,对实验内容和实验方法进行了优化,并采取研讨式分组教学模式,使学生能够深入、全面、系统地理解和掌握蛋白质免疫印迹技术,提高了实验教学质量,并有助于培养学生的科学思维、科学素养以及综合实践能力。

立足人才培养 构建生化实验室多元化管理模式

实验教学一直是人才培养过程中的一个重要环节,而良好的实验教学效果在很大程度上依赖于实验室的高效管理模式。经过多年的探索与实践,生化实验室立足于实践型创新人才的培养,构建了综合"区域管理、开放管理、绿色管理"三大管理理念为一体的多元化管理模式,为人才培养提供了一个增加实践机会、激发学习兴趣、培养创新意识的保障性平台。

实时荧光定量PCR技术在实验教学中的应用

设计了"实时荧光定量PCR分析IPTG诱导EGFP基因在大肠杆菌中的异源表达"实验,研究IPTG诱导浓度和温度对EGFP基因表达的影响。结果表明,IPTG浓度为270μmol/L、诱导温度为16℃、诱导时间为18h的条件下,EGFP mRNA的表达量最大。通过该实验的学习,使学生掌握实时荧光定量PCR的相关实验原理、技术以及实时荧光定量PCR仪的使用,培养学生的科研能力和综合素质。

大鼠前列腺间质增生模型的建立

为建立前列腺间质增生的动物模型,将大鼠随机分为假手术组、去势组、去势+雄激素组、去势+雌激素组、去势+不同比例的雌/雄激素组(1∶50,1∶100,1∶200,1∶300),考察各实验组的前列腺指数、组织切片的形态学和平滑肌特异蛋白免疫组化染色的变化.结果表明与正常组比较,凡施用雌/雄激素组的前列腺指数均明显增高,以1∶100和1∶200组尤为明显.去势+不同比例雌/雄激素组较正常组的前列腺组织增生明显,而且间质中平滑肌细胞成分在雌/雄激素比例为1:100组明显增加.因此,用雌/雄激素协同作用诱导大鼠前列腺间质增生的最佳比例为1∶100.

染色质免疫沉淀技术在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想的方法。近年来这种方法与DNA芯片和分子克隆技术相结合,可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况,这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网络。总结了染色质免疫沉淀技术的方法,特别介绍了使用这些方法取得的最新进展。