禽网状内皮增生症病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得分泌抗禽网状内皮增生症病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,通过表达pET32a-gp90重组蛋白,以纯化的gp90蛋白为抗原,免疫BALB/c鼠,筛选分泌抗REV McAb的杂交瘤细胞株。经过细胞的融合及筛选,共获得能稳定分泌抗REV gp90的McAb细胞系2株,分别命名为A9E8和B3F8。2株细胞培养上清的效价均在1∶4×102以上,腹水效价均在1∶8×103以上。亚型鉴定结果表明,2株皆为IgG型,轻链均为κ链;Western blot及间接免疫荧光结果显示,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能识别REV全病毒抗原,与其发生特异性反应,并且不与禽类其他病毒发生反应;病毒中和试验结果表明,获得的单克隆抗体均能REV临床分离株发生中和反应,具有较好的中和活性。利用制备的单克隆抗体建立了REV的间接免疫荧光检测方法,临床病料检测结果表明,该方法与病毒分离及PCR的检测结果基本一致,阴、阳性符合率分别为100%和90%。作者制备了针对REV gp90的McAb,为REV的快速诊断及抗原表位分析与鉴定等奠定了基础。

禽网状内皮增生症病毒gp90基因真核表达及ELISA检测方法的建立

为建立禽网状内皮增生症病毒(REV)的ELISA检测方法,本研究通过RT-PCR方法扩增gp90基因,构建杆状病毒重组质粒,转化DH10Bac后,通过转座获得重组杆粒,并将其转染Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE及western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约为45 ku,具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白纯化后包被ELISA反应板,建立检测REV抗体的rgp90-ELISA方法。特异性试验结果表明该方法具有良好的特异性;将该方法与IDEXX公司生产的试剂盒共同检测包括63份已知背景的血清在内的黑龙江省和广东省的临床血清样品共477份,符合率分别为90.5%和86.4%。该方法的建立为禽群REV抗体的监测提供了方便、快捷、准确的技术手段。

CpG基序对新城疫病毒DNA免疫效果的影响

为评价CpG基序对新城疫病毒(NDV)DNA免疫效果的影响,本研究将NDVF48E9株的F基因分别克隆至真核表达载体pVAX1和含有3个CpG基序的载体pVAX1-CpG中,分别命名为pV-F和pVC-F,体外表达检测结果显示,pV-F和pVC-F外源基因表达量无明显差别。将pVAX1、pVAX1-CpG、pV-F和pVC-F经腿部肌肉多点注射3周龄SPF鸡(200μg/只),2周后以相同的剂量加强免疫,二免后2周通过滴鼻以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒。抗体检测结果表明,免疫组的抗体水平与对照组相比差异显著(p<0.01),pVC-F免疫组的抗体水平高于pV-F免疫组;淋巴细胞检测结果表明,pV-F和pVC-F免疫组与对照组显著差异(p<0.01);攻毒保护率结果显示,pVC-F和pV-F组的保护率分别为60%和50%,对照组为0。以上结果表明,CpG基序对机体细胞免疫反应有一定的增强作用。

鸡传染性支气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LTJ95Ⅰ株病毒攻击的免疫保护

将共表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγS1)接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用同源(LX4株)及异源强毒株(LTJ95I)攻毒,评价重组疫苗对异源病毒的保护作用。结果显示,重组疫苗接种1周后,免疫鸡产生抗IBV的抗体;而且外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的含量略高于非免疫对照组;攻毒后,异源强毒株攻毒的免疫组CD4+T淋巴细胞呈下降趋势,并且该组低水平CD4+的状态一直持续到试验结束,而其他组CD4+T淋巴细胞均迅速上升,峰值达到14.5%;同源强毒株攻毒的免疫组CD8+T淋巴细胞呈高水平的表达,而其他组攻毒后均无明显变化;保护率结果显示,同源强毒株攻毒免疫组的发病率和死亡率为21.43%和0%,与其他各组相比均有显著差异;另外同源强毒株攻毒的免疫组病理损伤与异源强毒株攻毒的试验组相比明显减轻,其排毒时间和排毒量也均有所减少;强毒攻毒后所有试验组体重无显著差异。以上结果可以说明,重组疫苗能对同源强毒株产生较好的免疫保护,但不能对遗传关系较远的强毒株产生有效的免疫应答。

传染性支气管炎重组鸡痘病毒免疫鸡对LHLJ04XI株病毒攻击的免疫保护作用

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγ S1)接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击,评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组病毒在免疫后1周即可检出ELISA抗体,并且免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均有显著上升。当用LHLJ04X I株病毒及亲本毒LX4攻击后,免疫鸡的肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等脏器的病理损伤程度明显轻于非免疫对照组,排毒时间缩短,攻毒后现地分离株攻击的免疫组的发病率为27.3%(3/11),死亡率为9.1%(1/11),亲本毒攻击的免疫组发病率为26.67%(4/15),死亡率为6.67%(1/15),两者没有明显差异,而非免疫对照组的发病率和死亡率分别为100%(11/11)和45.5%(5/11),与免疫组相比差异显著,说明重组疫苗对免疫鸡具有较好的保护效果。体重测定结果表明,攻毒前重组疫苗免疫组和非免疫对照组的体重差异不显著(P>0.05),攻毒以后免疫组体重的增加幅度高于非免疫对照组。以上结果表明,共表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒活载体疫苗能对异源现地分离株的攻击产生较好的免疫保护,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。

基因修饰的鸡新城疫病毒HN基因DNA疫苗免疫效力评价

为了评价基因修饰对提高DNA疫苗免疫效果的影响,将NDV F48E9株HN基因进行密码子优化和信号肽替换,修饰后的基因命名为SoptiHN,将HN和SoptiHN基因分别克隆至pVAX 1和含CpG-ODN刺激序列的载体pVAX 1-CpG中,共获得pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-HN和pVC-HN 4种质粒。将4种质粒股四头肌多点注射3周龄SPF鸡,每只鸡200μg,以PBS为非免疫对照;一免后3周以相同的剂量加强免疫,二免后2周以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒,计算发病率、死亡率以及排毒情况。试验期间每周采集血清进行HI抗体的检测,同时采集抗凝血分离外周血淋巴细胞,分析免疫后各试验组IFN-γ和IL-18的变化情况。结果表明,疫苗免疫1周后,所有免疫组均能产生抗NDV的HI抗体,pV-SoptiHN和pVC-SoptiHN组最高,与其他组差异显著;pVC-SoptiHN和pVC-HN质粒免疫组IFN-γ和IL-18表达水平要略高于pV-SoptiHN和pV-HN质粒免疫组。攻毒结果显示,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的死亡保护率均为71%,排毒检出率均为25%,而pV-HN和pVC-HN免疫组的保护率均为50%,排毒检出率分别为50%和44%,pVAX1、pVAX1-CpG和PBS对照组攻毒后的死亡率均为100%,排毒检出率均为100%,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的排毒时间与其他5组相比有所缩短。以上结果表明,修饰后的HN基因可以诱导鸡产生更强烈的免疫反应,获得更好的保护效率。

表达传染性支气管炎S1基因和IFN-γ基因重组鸡痘病毒安全性与最适免疫剂量分析

对共表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因和II型干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFNγS1）冻干疫苗进行安全性和最适免疫剂量的研究。取冻干疫苗，加生理盐水恢复至冻干前体积，分别取0.1 mL经翅内侧无血管处皮下接种1周龄SPF鸡，接种剂量为1.0×10^5PFU，接种后3 d出现局部反应，5 d局部肿胀达到最大，接种鸡无其它全身反应，精神、食欲以及发育等均不受影响，说明重组病毒对实验鸡是安全的。将重组疫苗用生理盐水作倍比稀释后翅内侧无血管处皮下接种4周龄SPF鸡，接种剂量为1.0×10^1-1.0×10^4PFU，免疫后3周攻击传染性支气管炎病毒LX4株。结果表明，在接种剂量为1.0×10^2-1.0×10^4PFU的剂量范围内均可以使全部实验鸡产生局部反应，并对IBV的攻击形成保护，降低免疫鸡的发病率和死亡率，发病保护率达到73%以上；1.0×10^1PFU接种实验鸡后，仅有5/11的鸡出现局部反应，对IBV攻击的发病保护率为64%，与对照组差异不显著（P〉0.05）。以上结果说明，疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性，根据疫苗生产使用实际情况确定传染性支气管炎重组鸡痘病毒疫苗的最适免疫剂量为10^3PFU。

产植酸酶的黑曲霉菌株的筛选与选育

对实验室保存和购买的 9 株黑曲霉菌株进行了产植酸酶酶活测定,筛选出一株产植酸酶较高的菌株 3928,酶活达 693 μg/(g·min)。该菌株经紫外线诱变处理,可得到一株产植酸酶较高的 2 号菌株,酶活达到 2 050 μg/(g·min)。

鸡传染性支气管重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LHB株病毒攻击的免疫保护

rFPV-IFNγS1是一株共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒,将其接种SPF鸡3周后,用传染性支气管管炎病毒异源毒株攻击,考察重组疫苗对异源毒株攻击的保护作用。结果显示,疫苗接种后,免疫鸡血清中抗体很快产生,外周血中CD 4+和CD 8+T淋巴细胞与非免疫对照组相比都有显著差异。用LHB株IB病毒攻击后,免疫鸡的病理损伤明显轻于非免疫对照组,并且其排毒时间明显缩短,排毒量明显减少,攻毒后免疫组的发病率为30%(3/10),死亡率为10%(1/10),非免疫对照组的发病率为100%(10/10),死亡率为40%(4/10)。体重分析结果表明,攻毒前后免疫组与对照组相比,体重均没有显著变化,但攻毒后免疫组鸡体重增长的幅度要高于非免疫对照组。从以上结果可以说明,重组疫苗能在动物体内很好表达,对试验动物产生较好的保护作用,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒

根据猪瘟病毒 ( CSFV)、猪细小病毒 ( PPV)和猪伪狂犬病病毒 ( PRV) 3种病原体的基因保守序列 ,分别设计了与CSFV的 E2基因、PPV的 VP2基因和 PRV的 g 基因序列互补的 3对引物。用这 3对引物对人为混合的样品中的PPV和 PRV的 DNA模板及 CSFV反转录后的 c DNA模板进行多重 PCR扩增和多重 PCR反应条件的优化 ,结果同时得到 3条与试验设计相符的 2 88bp( CSFV)、5 75 bp( PPV)和 70 0 bp( PRV)特异性条带 ;敏感性检测结果表明 ,该多重 PCR可以检测到 14 .5 ng/ L 的 CSFV、2 7.1pg/ L 的 PPV、31.4 ng/ L 的

利用Rde/ET技术构建表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒

【目的】本研究以火鸡疱疹病毒(HVT)BAC分子克隆为平台,构建表达禽流感HA基因的重组火鸡疱疹病毒,以开发新型病毒活载体疫苗。【方法】利用Red/ET重组技术,经过两步法重组:第一步,用两端带有50bp大小左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsL-neo表达盒替换HVT基因组US2区;第二步,用两端带有同样的50 bp左、右同源臂a和b的HA基因表达盒替换选择标记基因rpsL-neo表达盒。在含有氯霉素和链霉素双抗性的平板上筛选阳性克隆,经卡那霉素抗性反向筛选和PCR进一步鉴定,鉴定正确的克隆命名为pHVT-HA。提取并纯化pHVT-HA DNA,转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),以完成重组病毒的拯救。【结果】命名为pHVT-HA3的BAC克隆转染CEF后第4天,出现病毒噬斑,噬斑形态与野生型HVT相似,获得拯救的重组病毒,命名为rHVT-HA3,将重组病毒rHVT-HA3在CEF上连续传代培养,经PCR和间接免疫荧光检测表明,重组病毒在连续传代过程中仍能稳定表达HA蛋白。【结论】本研究以HVT BAC为平台,利用Red/ET重组技术,构建了表达禽流感A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的血凝素(HA)基因的重组火鸡疱疹病毒,为新型禽流感重组活载体疫苗开发奠定基础。

抗菌肽及其功能研究

抗菌肽是近年来发现的广泛存在于自然界的一类阳离子抗菌活性肽,越来越多的证据表明它们在宿主先天性免疫和适应性免疫中有着重要的作用。对抗菌肽的研究正不断深入。先从抗菌肽研究的历史背景出发,简要介绍了抗菌肽的特性;然后从抗菌肽的直接抗菌活性和免疫调节功能这两个方面重点阐述其在宿主防御过程中的作用,最后对抗菌肽的临床应用及前景作了概述。

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

为构建全基因组鸡马立克氏病病毒814株感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC),首先通过构建表达Eco-gpt(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase,XGPRT,gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1-3 kb)和带有细菌人工染色体的基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11,将重组病毒转移载体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞,在选择培养基中经过8轮加压筛选,获得并纯化重组病毒;将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌,筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒,提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果表明,MDV-BAC2 DNA再次启动病毒感染,拯救了重组鸡马立克氏病病毒。成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体,为方便利用现代RED/ET基因重组系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台;同时为研究鸡马立克氏病病毒的基因功能和开发新型马立克氏病疫苗奠定了基础。

优化的复合自动诱导培养基(CAI-4)对外源蛋白在大肠杆菌中表达的影响

[目的]原核表达系统是目前最为广泛使用的一种外源蛋白表达系统。在利用原核表达系统表达目的蛋白的过程中，可溶性外源蛋白的产量是决定成本和效率的决定性因素。[方法]本项研究中利用本实验室构建的7种不同的重组质粒（p-1、p-2、p-3、p-4、p-5、p-6、p-7），检测其在复合自动诱导培养基中的表达情况，评价哪一种培养基更适合于外源蛋白的表达，提高目的蛋白的产量。[结果]结果显示，这7种重组蛋白在复合自动诱导培养基的表达量是普通LB培养基的4-8倍；并在此基础上，对复合培养基的成份进行进一步优化，形成了一种优化培养基（改良培养基-4），P-1、P-2、P-3这3种融合蛋白在这种改良培养基中的表达量比优化前提高了至少2倍。

表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

为构建表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的重组疱疹病毒(HVT),本研究将AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的HA基因克隆于真核表达质粒中,构建了转移载体pUAB-gpt-HA。通过同源重组及霉酚酸筛选技术,将HA基因表达盒插入到HVT US10基因区,构建了一株表达H5亚型AIV HA基因的重组病毒HVT(rHVT-US10-HA)。经PCR、间接免疫荧光、western blot及红细胞凝集试验鉴定,重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。rHVT-US10-HA的构建为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;能够检测初始模板中10-3EID50的病毒核酸及16拷贝的标准品;与其它相关的鸡源病毒均无交叉反应,并且批内、批间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。该检测方法的建立为ILTV的临床检测和定量分析提供了一种快速、准确的技术手段。

火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建

火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。【目的】本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)。【方法】利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和BAC载体pBeloBAC11的基本功能序列,构建重组病毒转移载体pGAB-gpt-BAC11。通过将pGAB-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病毒噬斑后,利用霉酚酸(MPA)阻断核酸代谢途径,经过筛选获得纯化的重组病毒purified-rHVT。提取purified-rHVT感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆,并用酶切和PCR方法对其进行鉴定。随机选取BAC克隆提取BACDNA转染次代CEF,完成HVT重组病毒的拯救。【结果】经过6轮筛选后获得纯化的重组病毒,并筛选到25个BAC分子克隆化病毒。其中BAC6、BAC8和BAC10再次启动病毒感染,产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态,说明已经获得拯救出的HVT重组病毒。【结论】本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体,建立了HVT反向遗传操作技术平台。