真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制探究

为探讨真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制,以新疆紫草无菌苗为试材,经尖孢镰刀菌、立枯丝核菌制备成的诱导子生物诱导后,对其根部进行RNA测序和分析。结果表明,与对照组比较,尖孢镰刀菌试验组差异表达基因1735个;立枯丝核菌试验组差异表达基因1043个。GO(gene ontology)分析发现,2个试验组差异表达基因主要富集在细胞过程、细胞组分中膜和分子功能中催化活性等生物学过程。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析发现,2个试验组在植物与病原菌互作、植物激素信号转导途径和苯丙素合成等通路均有大量差异表达基因富集。2个试验组差异表达情况相同的转录因子主要包括bHLH、AP2/ERF-ERF和LOB等,并发现参与紫草素合成及其正向调控的AeGHQH、AeDSH1、AeAP、AePAL、AeDI2、AePGT、AeHMGR、AeG10H基因在2个试验组均上调表达,其中尖孢镰刀菌试验组上调表达较显著。以上结果从分子水平探究了新疆紫草对真菌诱导子生物诱导的响应机制,为未来真菌诱导子应用于新疆紫草种植生产奠定了理论基础。

农杆菌介导的“野大1号”高效遗传转化体系建立

栽培大豆在驯化过程中丢失了大量的优异基因,我国野生大豆种质资源丰富,蕴含着许多高蛋白、抗逆方面的基因。大豆新品种“野大1号”作为一份重要的种质资源,保存着宝贵的遗传基因和许多优良的性状,具有较高的营养价值,其中异黄酮的含量高达千分之二,在农业育种上具有重要的价值。本研究以“野大1号”为材料,通过设计不同的消毒方式和时间以及不同的芽诱导6-BA浓度配比,通过GUS染色方法比较摇床和针管真空渗漏两种侵染方式在不同侵染时间下对基因转化效率的影响,分析侵染后外植体最佳抗生素筛选浓度,建立“野大1号”大豆品种的高效遗传转化体系。结果表明:“野大1号”种子消毒最佳方法为75%酒精消毒45 s后再使用15%过氧化氢消毒30 min;最佳侵染方法为针管真空渗漏浸染30 min;最佳不定芽诱导培养基为MS+2 mg·L^(-1)6-BA;抗性筛选标记潮霉素的最适浓度为60 mg·L^(-1)。通过该遗传转化体系成功移栽了14株植株,其中8株为转基因阳性植株。该高效再生及遗传转化体系的建立为大豆的新品种培育奠定坚实基础。

天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建

以天山雪莲(Saussurea involucrataKar.et Kir)幼嫩叶片为研究材料,利用CreatorTMSMARTTMcD-NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cfu/mL,文库插入片段多在1 000 bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。

杂花苜蓿高效再生体系的建立

通过对新疆塔城杂花苜蓿品种下胚轴再生植株的系统研究，经筛选获得种子萌发培养基为：1／2MS无糖培养基；胚性愈伤组织诱导培养基：MS＋2，4-D2mg／L＋6-BA0．5mg／L＋蔗糖3％。胚性愈伤组织诱导率为100％；胚状体诱导培养基：SH＋2，4-DZing／L＋6-BA0．5mg／L＋CH250mg/L＋蔗糖1％，胚状体诱导率为86．96％；胚状体萌发培养基：SH＋GA30．5mg／L＋CH250mg／L＋蔗糖1％，胚状体萌发率为90％-95％；生根培养基：1／2MS＋IBA0．5rag／L＋蔗糖1％。生根率为100％。完成再生时间120d左右。

棉花叶片对卡那霉素反应效果的研究

利用不同浓度的卡那霉素对棉花叶片进行处理，较为系统地研究了棉花不同品种、不同叶位、不同生育时期内叶片对卡那霉素处理的反应。研究表明，不同棉花品种间叶片对卡那霉素处理的反应呈相同的变化趋势，彼此间差异不显著。不同叶位之间，随着叶龄的不断增长，其对卡那霉素抗性显著增强。同时随着生育期延后。

大肠杆菌不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体的构建

不耐热肠毒素LT是肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)分泌的一种热不稳定性肠毒素,由A、B两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白,是目前人们发现的最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一。本研究利用基因工程技术,从强致病菌株K88ac中,分别克隆了LTA和LTB基因,并利用高效植物表达载体pBI121、pBLG和pCAMBIA2300成功构建了带有内质网滞留信号RDEL/KDEL不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA-LTB。为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。

棉花花粉介导基因转化的初步研究(简报)

棉花是干柱头花，花粉粒对低渗透压的溶液非常敏感，极易破裂。１９９７年我们对海南和南疆以及北疆都进行了不同花粉萌发培养基和渗透压的调节的研究工作，设计了不同品种、不同渗透压、不同糖类、不同离子浓度、不同激素组合、不同温度等多因子不同水平的试验，结果表明...

小果雪兔子的组织培养

小果雪兔子分布于新疆帕米尔高原，是一种濒临灭绝植物。利用组织培养的方法研究和保存珍稀的种质资源，是一种有效途径。以小果雪兔子无菌苗下胚轴为外植体，在含有6-BA（0．2mg／L）和NAA（2mg／L）的MS固体培养基上，20d后可诱导出紫红色愈伤组织。当经4℃处理的愈伤组织转移到含6-BA（2mg／L）＋NAA（0．2mg／L）＋水解乳蛋白（2．50mg／L）的MS培养基上，25d后在愈伤组织上即可诱导出芽，出芽率为240％，继代培养后形成丛生苗，增殖率可达3．5倍。将2-3cm长的幼苗，转移到IAA（0．5mg／L）＋活性炭（0．5％）的1／2MS固体培养基上，20d即可从茎基部生根，生根率74％。

矮牵牛自交不亲和性基因sx的克隆及功能初步分析

利用NCBI、CODEHOPE、Primer Premier5.0等数据库和生物软件设计兼并引物,以矮牵牛花柱cDNA为模板,利用RT-PCR扩增到1条长为417 bp的序列,在GenBank中比对发现,该序列与SX基因相似性最高。然后以SX序列为模板设计特异性引物,RT-PCR扩增到1条全长为747 bp的目的片段,测序结果分析表明,该基因核苷酸序列开放阅读框全长660 bp,编码220个氨基酸,其中包括有22个氨基酸的跨质膜信号肽区,和5个保守区(C1-C5)以及2个高变区(Hva,Hvb),据前人研究所知,该基因具有S-核酸酶功能。同时,从番茄DNA中克隆到一长为717 bp的花粉特异性启动子LAT52。为了使SX基因能在花粉中发挥其S-核酸酶功能,去掉22个氨基酸跨质膜信号肽(命名为sx)之后,与番茄花粉特异性启动子LAT52嵌合构建植物表达载体并转化拟南芥。TTC染色结果表明,LAT52能特异性的在花粉中调控sx基因的表达,使花粉活力很低甚至没有活力,从而使转基因植株不育。

大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体的构建

目的:构建可高效表达不耐热肠毒素LT的双价植物表达载体。方法:采用PCR的方法从强致病菌株中K88ac中,分别克隆了LTA和LTB基因,将LTA和LTB基因同时连接到植物表达载体pBI121上。结果:成功构建了带有内质网滞留信号RDEL/KDEL的不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA-LTB。结论:构建的双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA-LTB,为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。

转基因棉花的田间筛选技术研究

利用不同浓度的卡那霉素对棉花叶片进行处理 ,较为系统地研究了棉花不同品种、不同叶位、不同生育时期内叶片对卡那霉素处理的反应。在此基础上建立了一种在田间对转基因棉花进行筛选的简便方法。研究表明 ,在棉花花铃期以前 ,利用 50 0 0～ 750 0 mg.L- 1卡那霉素对转基因棉花新展开的倒 1叶和倒 2叶进行检测 ,能够有效筛选出带有卡那霉素标记基因的转基因后代 ,这对于转基因棉花材料的选育有较大的利用价值。

利用目的基因转化技术培育棉花抗病新品种

用花粉管通道法将菜豆几丁质酶基因与烟草 β 1、3葡聚糖酶基因双价植物表达载体pBLGC导入新疆棉花主栽品种 (系 )系 5 5 0、82 2、130 4、石远 32 1。通过卡那霉素检测、PCR Southern验证、抗黄萎病、枯萎病性筛选 ,得到抗病性良好且遗传性稳定的转基因棉花。经过 6年 10个世代的选育 ,育成抗枯萎病、抗 (耐 )

转过氧化氢酶基因KatG棉花的抗旱性

以导入过氧化氢酶基因KatG的第3代转基因棉花为供试材料,通过大田试验,从卡那霉素检测出来的棉花植株中,经PCR筛选出阳性植株并进行抗旱性研究。结果显示,转基因棉花发芽率达86%以上,苗期叶绿素含量有显著增加;在苗期、蕾期和花期水分胁迫下,转KatG基因棉花在蕾期与花期的过氧化氢酶(CAT)活性显著增加;净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2摩尔分数(Ci)和光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)显著高于对照;农艺性状的分析表明,转基因棉花抗旱性有明显提高;在干旱胁迫条件下,转KatG基因棉花表现出优良的生长和生理优势,可提高棉花抗旱能力。

新疆野生羊肚菌物种多样性研究

根据子实体形态特征并结合r DNA ITS(Internal Transcribed Spacer)序列分析技术分析了根据形态特征挑选的、采自新疆伊犁、塔城、石河子、乌鲁木齐、阿勒泰五地区的31株野生羊肚菌子实体。r DNA ITS序列分析表明,采自新疆兵团185团且形态学分类为半开羊肚菌(Morchella semilibera)的2株菌株实为羊肚菌科常见属钟菌属的皱盖钟菌(Verpa bohemica)。以2株皱盖钟菌作为外类群,29株样品与来自Gen Bank的羊肚菌属各物种进行ITS序列聚类,可以分为四大聚类群,其中25株菌株与Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26聚为第I类群;半开羊肚菌单独聚为第II类群;1株菌株与Morchella frustrata聚为第III类群;3株菌株与Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7、Morchella sp.Mes-17共同聚为第四类群。结合形态学特征,初步认为,上述五地区羊肚菌属至少由7个物种构成。根据国内最新研究资料,其中2种为中国新纪录种,分别为Morchella sp.Mes-17和Morchella frustrata(中立羊肚菌)。

甘草内生真菌的分离及鉴定

植物体内普遍存在着内生菌,为了探寻传统药材甘草的质量与其内生菌之间可能存在的关系。对采自新疆的甘草根部进行了内生真菌的分离及鉴定。选用CYM真菌培养基,对其内生真菌进行分离及纯化,选择其中最占优势的两种菌落分别进行了菌落形态观察及菌丝形态(棉兰染色)观察,以及基因组DNA的18S rDNA和ITS rDNA序列鉴定和系统进化分析。本研究结果表明从甘草根部主要分离到两种内生真菌,分别属于Fusarium镰刀菌属和Gibberella赤霉菌属。

转天山雪莲冷调节蛋白基因烟草的获得及其抗寒性鉴定

从已建立的天山雪莲cDNA文库中随机挑取单克隆,采用通用引物M13扩增出基因序列并测序,然后将该序列在GenBank中进行比对,根据该序列设计特异引物进行PCR,最终获得了冷调节蛋白基因siCOR的完整开放读码框(ORF);构建植物表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因烟草,用RT-PCR对转化烟草进行鉴定,收取种子后筛选出纯合的T3株系,并通过冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果表明:(1)siCOR大小661bp,与禾本科植物粳稻的冷调节蛋白基因一致性最高(65.04%)。(2)与野生型植株相比,转siCOR基因烟草均叶片浓绿、无分支侧芽,生长快;在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因的烟草叶片相对含水量、PSⅡ相对量子产率降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株,而且转siCOR基因烟草植株叶片出现萎蔫症状的时间较迟、程度较轻,受到的伤害也较轻。研究发现,在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因烟草植株表现出良好的生理和生长优势,显示出了较强的抗寒特征。

不同浓度烯效唑与胺鲜脂复配剂浸种对玉米幼苗抗旱性的影响

用不同质量浓度烯效唑、胺鲜脂配比的复配剂对玉米种子‘郑单958’进行12h及24h的浸种处理,测定玉米的发芽情况、幼苗形态指标以及干旱胁迫下玉米幼苗叶片的相对含水量、相对电导率、丙二醛浓度、过氧化氢酶活性、叶绿素质量分数。结果表明,当40mg/L烯效唑、50g/L胺鲜脂配比下浸种24h时,显著抑制玉米种子的芽长,但对玉米种子的发芽率影响不大,促进幼苗壮苗的形成;对干旱的抗性响应因浸种时间不同而异,在浸种12h时,不同质量浓度烯效唑、胺鲜脂配比的混合剂中烯效唑质量浓度高效果优于质量浓度低的处理,而在浸种24h时,烯效唑质量浓度低效果反而优于质量浓度高的处理。通过形态及生理指标的测定,已明确40mg/L烯效唑、50g/L胺鲜脂的配比质量浓度进行浸种处理24h对玉米有较好的壮苗效果及提高植物抗逆性的作用。

低温胁迫对转新疆雪莲sikRbcs2基因烟草光合作用的影响

研究分布于新疆的雪莲(Saussurea involucrata)中的sikRbcs2基因在低温条件下对植物光合作用的影响,以16、10、6、4℃温度梯度处理非转基因型和转sikRbcs2基因型烟草,每个温度处理72 h,比较研究其叶绿素荧光特性和光合特性。实验分析结果:低温胁迫下,转基因型烟草叶片叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)、叶绿素a+b(Chla+Chlb)、类胡萝卜素(Car)含量都显著高于非转基因型烟草。叶绿素荧光参数分析:低温胁迫下,转基因烟草PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、q P(光化学猝灭系数)、ETR(电子传递效率)都显著或极显著高于非转基因型,光合参数测定:随着低温胁迫程度的加剧,转基因烟草和非转基因型烟草净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO_2浓度(Ci)总体都呈下降趋势,但转基因烟草的净光合速率有一个明显的动态变化,先急剧下降后有一个稳定上升的趋势。通过对生长指标的测定发现:在低温处理后和恢复后转基因烟草生物量的积累都显著高于非转基因型烟草。研究结果表明:转新疆雪莲sikRbcs2基因的烟草在低温条件下具有较高的Fv/Fm、q P、ETR,对光合机构的损伤小,降低了低温胁迫效应,提高了烟草在低温胁迫条件下的耐受性。