2型猪链球菌天津分离株的鉴定及其遗传特征分析

为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75。测定其生长曲线、并按照文献方法进行溶血性试验、黏附/侵入试验和对小鼠的致病性试验,分析该SS2分离株特性。结果显示,TJS75菌株经TSB培养6 h~15 h可达对数生长期,对绵羊血红细胞(RBC)具有崩解效果,可黏附并侵入PK-15细胞(黏附率和侵袭率分别为5.16%和7.90%),且感染TJS75株的BALB/c小鼠出现不同程度的行动迟缓、呼吸急促、精神萎靡和神经症状等,经测定其LD50为2.15×107cfu/mL。进一步采用高通量测序,并预测其毒力基因,分析该菌株的遗传特征,结果显示,TJS75菌株基因组全长2368195 bp,GC含量40.88%,含有2299个编码基因,其中有1822、1830和1077个基因分别注释于GO、COG和KEGG数据库,携带的16S r RNA基因序列与国内分离的SS强毒株98HAH33和05ZYH33的亲缘性较近,毒力基因的预测结果显示该菌株携带499种毒力相关基因(编码173种毒力相关因子),依据功能分类,这些毒力基因参与SS2的黏附和侵袭、溶血、促进铁转运、自溶酶的合成、降解胶原酶、唾液酸的合成等。本研究首次分离到携带MRP毒力因子的ST25型SS2,为深入开展SS2 TJS75株的致病机制研究提供了科学依据。

一株猪源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

为确定黑龙江省某养殖场因呼吸道症状急性死亡病猪的致病菌,并探究其主要生物学特性,本研究采集病死猪内脏组织,通过细菌分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S r RNA基因的PCR扩增、测序、系统进化树的构建对分离菌进行种属鉴定;通过微量肉汤稀释法分析该菌对8类10种抗生素的敏感性;通过Illumina PE150对细菌全基因组测序,采用ResFinder软件分析分离菌的耐药基因,并分析耐药基因与耐药表型的相关性。利用VFanalyzer软件、BLASTN比对分离菌的毒力基因。结果显示,该菌株在10%脱纤维羊血平板培养基上培养24 h后形成表面光滑具有β-溶血环的单菌落;革兰氏染色结果显示呈蓝紫色短棒状杆菌;生化鉴定结果显示该分离菌的生化特性与化脓隐秘杆菌符合。16S r RNA基因的PCR结果显示,扩增到1397 bp的目的基因序列,与GenBank中序列比对结果显示该菌株与已报道的化脓隐秘杆菌同源性高达99%。16S r RNA基因系统进化树分析结果显示分离菌与辽宁沈阳的牛源化脓隐秘杆株TZQ 01株处于同一分支,与日本的猪源分离株NIAH13531处于较近分支,以上结果可确定该分离菌为化脓隐秘杆菌,并将其命名为FY-4-Z-1。药敏试验结果显示,该菌株对头孢菌素类的头孢噻呋,青霉素类的青霉素、阿莫西林,大环内酯类的红霉素,截短侧耳素类的泰妙菌素等抗生素敏感,对四环素类的四环素,氨基糖苷类的链霉素耐药。利用组装软件SPAdes对获得的全基因组测序数据组装后获得了分离菌全基因组草图,结果显示分离菌基因组大小为2399.961 kb;耐药基因分析结果显示,该菌株基因组包含3种耐药基因,分别是氨基糖苷类的ant(6)-la、大环内脂类的erm(X)、四环素类的tet(W)耐药基因,其中在化脓隐秘杆菌中首次检测到ant(6)-la基因。该菌株对四环素和链霉素的药敏试验结果与其耐药基因检测结果相符,而红霉素敏感表型可能与其耐药基因erm(X)的移码突变有关。利用BLASTN和VFanalyzer软件进行毒力基因检测,结果显示共检测到8个已知毒力基因和24个候选毒力相关基因。本实验进一步丰富了猪源化脓隐秘杆菌的相关研究,为规模化猪场化脓隐秘杆菌病的防治提供了重要的参考依据和用药指导。

2型猪链球菌pnp基因缺失株与回补株的构建及其生物学特性的研究

为研究2型猪链球菌(SS2) pnp基因的生物学功能,本研究通过基因无痕操作技术构建SS2 05ZYH33pnp基因缺失株Δpnp以及回补株CΔpnp,经PCR和测序鉴定结果表明,正确构建了pnp基因无痕缺失株和回补株。将05ZYH33、Δpnp以及CΔpnp分别在不同温度(28℃、37℃、42℃)培养后测定OD_(600nm)值,绘制各菌株的生长曲线;利用革兰氏染色后经镜检及透射电镜观察各菌株的形态结构;通过滴定微孔平板结晶紫法检测各菌株的生物被膜形成能力;采用接触法分析各菌株的溶血特性;于含不同抗生素的THB平板上培养各菌株,分析各菌株的药物敏感性;于氧化条件与酸性条件下培养各菌株,通过统计存活率评价各菌株的氧化耐受与酸耐受能力。结果显示,缺失株的生长速率明显低于野生株和回补株,且在冷应激条件下的生存能力下降;与野生株和回补株相比,缺失株细胞壁肽聚糖层的结构更加松散、溶血能力下降、生物被膜形成能力下降、对不同类型抗生素的敏感性增强、抗氧化与抗酸能力均下降。上述结果表明pnp基因是SS2的一个重要调节因子,参与调节细菌对外界环境变化的适应能力。本研究为科学防控猪链球菌病以及研发新型抗菌药物奠定基础。

猪肺炎支原体Mhp-1株的分离鉴定及其全基因组测序分析

为了分离与鉴定引起的猪群疑似支原体性肺炎的病原体,本实验收集了20份病死猪肺脏病变组织,采用猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)特异性引物进行PCR鉴定、分析培养特性、颜色变化单位(CCU)测定、传代培养后扩增16S rRNA基因并测序分析等,并进一步采用BLAST分析分离菌16S rRNA基因序列的同源性,采用邻接法构建16S rRNA基因的系统进化树,对该分离株MLST分型、全基因组测序和毒力基因预测。结果显示,20份临床样品仅3份样品为Mhp单阳性,接种KM2液体培养基后仅1份生长良好,颜色规律性变黄;接种KM2固体培养基培养7 d后呈现特异性“煎蛋样”的菌落形态;瑞氏姬姆萨染色结果可见环状、点状、丝状、两级状等形状且大小不等的菌体形态,传12代后经特异性PCR检测结果为Mhp单阳性,表明该分离株可以稳定传代,且无Mhr污染;该分离株在KM2培养基上为1×10^(7)CCU/mL;16S rRNA基因序列比对结果显示该分离株与GenBank中登录的Mhp菌株ES-2(CP038641.1)同源性达100%。以上结果确定本研究分离出一株Mhp,并将其命名为Mhp-1。16S rRNA基因系统发育树分析结果显示,分离株Mhp-1与国外猪源Mhp分离株F7.2(KY264125.1)处于同一分支,亲缘关系最近;MLST分型结果显示Mhp-1分离株属于ST184型;全基因组测序获得序列大小为0.91 Mb,与已报道的Mhp基因组大小基本一致;毒力基因预测结果显示其存在EF-Tu、Lttp、P216、P102、P46、P97、PDH-B、Capsule、HlyA等毒力因子编码基因。本研究进一步丰富了Mhp的研究数据,为规模化猪场猪支原体性肺炎的防控提供参考数据。

苏里格气田A区块储层基础物性特征分析

储层基础物性分析对了解气藏、制定气田开发方案及研究气井合理生产制度都至关重要。以苏里格气田A区块实物岩心为基础,依次开展基础孔渗、矿物成分、扫描电镜和高压压汞实验分析,分析储层的微观结构特征。实验结果表明:1)目标区域属于低孔低渗碳酸盐岩储层,非均质性强;2)岩石以脆性矿物为主,黏土矿物质量分数极小(大部分岩石中黏土矿物质量分数小于2.0%);3)孔隙以粒间孔为主,孔隙形态多样,纳米级微裂缝少见,填充度不高,缝洞呈现几何式特征;4)最大进汞饱和度差异大,孔喉结构不均匀,分选性差,孔喉半径小且分布广。

富血小板血浆治疗黄褐斑系统评价和单臂meta分析

目的系统评价富血小板血浆(PRP)在黄褐斑应用中的临床疗效及安全性。方法计算机检索中国知网、万方数据、SinoMed、PubMed、Embase、Webofscience、Cochrane library数据库,以及中国临床试验注册中心和ClinicalTrials.gov自建库起至2023年1月收录的相关研究。使用MINORS工具对文献进行质量评价,采用Stata14.0进行单臂meta分析。结果共纳入19项研究,550例黄褐斑患者接受PRP治疗前后的数据。随机效应模型meta分析示PRP疗效显著,黄褐斑面积和严重度指数(MASI)下降6.82分(95%CI:-9.77,-3.87);改良MASI(mMASI)下降5.62分(95%CI:-7.79,-3.45);显效率为55.3%(95%CI:42.2%,68.1%)有效率为88.8%(95%CI:77.7%,96.7%);总体满意率为93.0%(95%CI:79.0%,100.0%)。meta回归分析显示:①联合治疗显效率高于单独PRP治疗(72.7%vs41.7%,P=0.011);②采用微针或水光注射等方式导入PRP的显效率高于浅表微注射(70.7%vs39.0%,P=0.011);③更长治疗或观察期的显效率高于较短期研究(71.9%vs 38.2%,P-=0.01)。结论PRP对黄褐斑疗效良好,不良反应轻,无明显长期不良事件。当联合治疗、采用微针或水光注射导入、采取更长治疗周期时,皮损可获得更显著的改善。

疱疹样天疱疮1例

报告疱疹样天疱疮1例。患者男,76岁。因躯干、四肢红斑、水疱伴瘙痒10个月就诊。皮肤科检查:躯干、四肢见大量红斑、丘疹、色素沉着斑,红斑基础上有针尖至绿豆大小水疱。疱壁较厚,呈半球状,疱液清亮,孤立分布,不融合,尼氏征阴性,部分水疱破溃,见浅糜烂面。皮损组织病理示:表皮内水疱形成,疱内见嗜酸性粒细胞及中性粒细胞,真皮浅层可见血管周淋巴组织细胞、嗜酸性粒细胞浸润。直接免疫荧光:表皮内细胞间IgG、C3网状沉积。诊断:疱疹样天疱疮。入院予甲强龙、环磷酰胺、卢帕他定、酮替芬、外用复方丙素氯倍他索软膏等治疗,9 d后原有水疱大部分干涸,好转后出院。6个月后电话随访患者无复发。

体外弓形虫感染小鼠巨噬细胞对其极化的影响

为探索体外弓形虫感染小鼠巨噬细胞对其极化的影响,本研究采用M-CSF诱导分离的小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞,在体外以弓形虫感染骨髓来源的巨噬细胞,分别于感染后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h收集细胞和细胞培养液,利用Griess法和Arginase活性试验对i NOS和Arginase-1的酶活性进行检测。通过荧光定量PCR和western blot方法分别从m RNA水平和蛋白水平测定巨噬细胞中i NOS和Arginase-1的表达量。结果显示,弓形虫感染巨噬细胞后细胞中的Arginase-1的m RNA和蛋白含量均显著上调表达,i NOS的m RNA虽有短暂小幅度上调,但蛋白的含量无明显变化。本研究表明弓形虫感染巨噬细胞后能够明显诱导静息状态的巨噬细胞朝向M2型的方向极化,从而改变巨噬细胞的表型和功能。本研究为进一步阐明弓形虫与机体免疫系统相互作用提供了实验依据。

数字媒体语境下的交互式虚拟视觉艺术创新

在当前的数字媒体时代中,传统视觉艺术正面临着前所未有的机遇与挑战。文章针对数字媒体语境下的交互式虚拟视觉艺术创新展开了较为深入的研究,同时结合笔者自身经验总结出了几点可行性较高的创新建议,其中包括进一步加强对视觉艺术观念的创新、进一步加强对数字媒体与传统媒体之间的相互融合、将高科技作为交互式虚拟视觉艺术的创新载体以及积极促进交互式虚拟视觉艺术的多维创新等,以期能够对业界同仁带来一些具有参考性的意见。

高寒地区奶牛乳房炎凝固酶阴性致病葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为调查高寒牧区引起奶牛乳房炎的凝固酶阴性致病葡萄球菌流行现状及耐药情况,本研究对呼伦贝尔地区3个规模化奶牛养殖场采用加州乳房炎测试法(CMT)进行高体细胞牛脂病检测,并采集330份牛奶样品,应用PCR方法、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和药敏试验等对样品中的葡萄球菌进行分离鉴定和耐药性分析。结果显示,该地区隐性乳房炎发病率达47.8%,共分离和鉴定出9种葡萄球菌60株(34.5%);60株葡萄球菌分为41个克隆谱型;60株葡萄球菌对青霉素和林可霉素的耐药率较高,分别为40.0%(24/60)和50.0%(30/60),表明这两种药是治疗乳房炎常用药物。本研究为高寒地区致病葡萄球菌引起的奶牛乳房炎临床合理用药及对病原菌的防控提供实验依据和指导。

头皮先天性成纤维细胞结缔组织痣伴脱发一例

成纤维细胞结缔组织痣临床少见,好发于儿童躯干部,本文报道一例6岁女孩头皮先天性成纤维细胞结缔组织痣伴脱发,经组织病理学确诊。本病多为良性病变,治疗以手术切除为主。

Spitz痣样恶性黑色素瘤一例

Spitz痣样黑素瘤(spitzoid melanoma,SM)是恶性黑素瘤的一种特殊亚型。本例患者表现为鼻部粉色结节,无痛性快速生长3个月,但表面破溃,早期误诊为化脓性肉芽肿,经组织病理诊断为Spitz痣样黑素瘤。

诗歌中“绿”水“青”山译法的认知范畴化研究

人类总是会在心理将各事物分类的过程,这一过程就是范畴化。本论文主要从认知范畴化视角研究诗歌中颜色词的译法,并以"绿"及"青"为例。"绿"和"青"两者的概念及其范畴边界都具有模糊性,而这些模糊性给诗歌的翻译造成一定困难。在文中提出了三种主要的译法来应对模糊颜色词的翻译。

利用CRISPR/Cas12a技术快速检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立

为建立可用于临床检测猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,本研究根据App apxIVA基因3’末端保守区,设计CRISPR/Cas12a特异性gRNA,在gRNA序列与靶序列结合位点的上下游区域内,利用Primer Premier 5.0设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,利用RPA引物扩增靶基因apxIVA,通过gRNA识别特异性靶基因序列,激活Cas12a蛋白单链DNA酶的切割活性,根据免疫层析试纸条检测原理设计单链DNA报告分子,使用免疫层析试纸条检测体系内报告分子是否被切割进而实现对靶基因的检测。并通过各反应条件的优化建立了一种针对APP的检测方法。反应条件优化结果显示,最佳单链DNA报告分子浓度及gRNA浓度分别为500 nmol/L、100 nmol/L;最佳孵育缓冲液为10%聚乙二醇,最佳反应时间为30 min。该方法仅对App的检测为阳性,而对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示该方法对App重组质粒标准品的检测下限可达10拷贝/μL,比普通PCR方法敏感性高1 000倍;重复性试验结果显示,该方法对3个不同稀释度重组质粒标准品的批内和批间重复性试验检测结果均一致,重复性较好。对40份小鼠的肺脏病料样品进行检测,结果显示本研究建立的方法检出27份阳性样品,且通过试纸条即可直接观察结果。常规PCR方法检出25份阳性样品,二者的符合率为95%。本研究所建立的方法具有操作简单、快捷、结果直观,无需昂贵设备等优点,为现地快速检测该病原提供了一种切实可行的技术手段。

2017年我国4个省份屠宰场猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为研究我国不同地区屠宰场猪链球菌的流行情况,本研究于2017年分别从河南、黑龙江、广东、宁夏4个地区大型屠宰场采集健康猪肺脏样品578份,进行猪链球菌的分离鉴定、血清型分型;通过微量肉汤稀释法测定分离株的最小抑菌浓度(MIC);PCR方法检测分离菌的耐药基因和毒力基因;通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析不同来源分离株间的亲缘关系。结果显示,从4省市共分离到猪链球菌46株,包括12种血清型和3种荚膜新型血清型,其中猪链球菌血清7型分离率最高,为30.4%,但不同地区血清型交叉密度较低。分离菌株表现出广泛耐药性,其中对红霉素、阿奇霉素、多西环素的耐药率较高,分别为91.30%、86.96%、86.96%,但分离株均对万古霉素敏感。红霉素类耐药基因erm和四环素类耐药基因tet的检出率均较高,其中erm(B)为97.83%,tet(O)为89.13%。PFGE结果显示不同地区分离菌株PFGE谱型差异明显,而同一地区分离菌株PFGE谱型相似或相同,提示同一地区猪链球菌存在克隆传播现象。本研究揭示了我国不同地区猪链球菌流行情况,为猪链球菌病的防控提供参考依据。

伪狂犬病毒人工感染小鼠模型的建立

为建立伪狂犬病毒（PRV）人工感染小鼠的模型，本研究采用PRV强毒株接种猪、羊及小鼠，疫苗株接种小鼠，应用组织病理技术观察PRV人工感染不同动物导致的组织病变。以1×10^2～4．5×10^4TCID50不同梯度剂量PRv强毒株通过滴鼻或皮下接种途径人工感染小鼠，6×10^4～2．7×10^5TCID50不同剂量疫苗株皮下接种小鼠，统计各人工感染剂量下小鼠存活率。感染PRV动物脑部病理切片经苏木素．伊红（HE）染色观察，结果显示PRV强毒株及疫苗株接种小鼠后与PRV感染猪、羊后出现相似病理变化，均可导致炎性细胞的浸润及大脑实质内小胶质细胞的增殖。免疫组化染色表明PRV可以感染小鼠脑组织。本研究最终采用小鼠作为实验动物，应用PRV疫苗株，采用1×10^5TCID50剂量通过皮下注射接种小鼠，在接种后6d观察病变。该实验模型为进一步研究PRV感染小鼠后的天然免疫机制提供了实验依据。

大光斑低能量1064nm Q开关Nd:YAG激光在皮肤科的拓展应用

大光斑低能量1064 nm Q开关Nd:YAG激光具有红外波长、短脉宽、大光斑、低能量等特点。近年研究发现该激光除治疗色素性疾病,还可引起皮肤一系列非热损伤的生物学事件,即光生物调节作用。本文就大光斑低能量1064 nmQ开关Nd:YAG激光在皮肤科的拓展应用进行综述,为该激光更灵活地用于治疗多种色素性疾病、皮肤老化、皮肤屏障功能受损、痤疮、病理性瘢痕及其他皮肤疾病提供依据。

猪链球菌细菌素的筛选及理化特性分析

为研究猪链球菌(SS)产生的细菌素,本研究以不同省份分离到的200株SS为研究对象,采用琼脂扩散法筛选具有抑菌作用的菌株;通过CGE网站进行ST型分型,利用PCR方法进行血清型分型;选出的菌株利用PCR方法检测细菌素相关基因;然后用BAGEL4对细菌素相关基因进行全序列基因功能分析,同时采用PCR分段扩增其基因簇;并分析SS所产细菌素的理化特性。结果显示,从200株SS中筛选出了21株可产生抑菌物质的SS,它们分布于不同的ST型和血清型。其中菌株xj-144和38-3携带SS细菌素编码基因sss基因和suiA基因,经BAGEL4分析菌株xj-144仅存在一个与suicin 65核心肽相同的细菌素,并无其他潜在细菌素,其完整的基因簇含有10个ORFs,产生的细菌素排除有机酸、过氧化氢干扰后,其粗提取液具有一定的耐热性、酸碱耐受性和蛋白酶稳定性,并对部分病原菌具有抑菌作用。本研究为进一步研究SS细菌素奠定了一定的基础,为实现细菌素替代传统抗生素提供了科学参考。

猪链球菌细菌素基因膜接合转移的研究

为研究猪链球菌细菌素基因能否在同种和不同种属之间转移,本研究对供体菌xj-144的红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO进行PCR鉴定,然后以携带猪链球菌细菌素基因的菌株xj-144为供体菌,分别以猪链球菌BAA和粪肠球菌JH2-2株为受体菌进行膜接合转移试验,并对接合子进行PCR检测,对经检测正确的接合子进行药敏试验,同时对接合子的细菌素基因簇和供体菌的可移动遗传元件经PCR鉴定,并对整合性接合元件进行基因序列分析。结果显示,供体菌xj-144携带红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO,与受体菌BAA和JH2-2株分别进行滤膜接合转移试验后正确获得了接合子BM-1和JM-1,接合效率分别为8×10;和8×10^(-7)。药敏试验结果显示,供体菌xj-144对红霉素和四环素耐药,受体菌BAA和JH2-2株对红霉素和四环素均敏感,接合子BM-1和JM-1均对红霉素和四环素耐药。且接合子经PCR均扩增出了猪链球菌细菌素的suicin65基因簇;同时,从供体菌和接合子中均经PCR扩增到转座子整合酶int基因;序列分析结果显示,细菌素基因簇与耐药基因ermB、tetO共定位于一个新的整合性接合元件ICESsuxj-144中。上述结果首次证实了猪链球菌细菌素基因可以跨种属水平转移,并且该基因的水平转移与转座子有密切关系,本研究为进一步探究细菌素基因的转移提供了参考依据。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因敲除菌株的构建及生长特性分析

为构建金黄色葡萄球菌杀白细胞素(PVL)基因敲除的菌株,本研究以pBT2温敏型质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因敲除质粒pBT2-ΔPVL,并经酶切鉴定。将其转化至金黄色葡萄球菌RN4220中经其修饰后电转化至金黄色葡萄球菌ATCC 49775中,在30℃和42℃多次交替传代并经红霉素抗性筛选,构建PVL基因敲除菌株,经PCR和测序鉴定后命名为ΔPVL。以pLI50穿梭质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因回补质粒pLI50-PVL,按照同样方法将其转化至敲除菌株ΔPVL中,构建PVL基因回补菌株CΔPVL。将ΔPVL在TSB培养基中连续传代培养后,经PCR检测敲除菌株体外的遗传稳定性;分别绘制敲除菌株ΔPVL和回补菌株CΔPVL的生长曲线,检测其体外生长特性。结果显示,正确构建了两种质粒pBT2-ΔPVL、pLI50-PVL和两种菌株ΔPVL、CΔPVL。敲除菌株ΔPVL连续传代未发生回复突变,具有良好的遗传稳定性。生长特性结果显示敲除菌株生长速率显著低于野生菌株,表明PVL基因在金黄色葡萄球菌的生长调节中发挥着一定的作用。本研究为进一步研究金黄色葡萄球菌PVL的功能及致病机制奠定了基础。