黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达

用PCR合成的黑曲霉 (Aspergillusniger)酸性α 淀粉酶 (Acidα amylase)的cDNA ,构建了由酵母醇脱氢酶(ADH1 )启动子和终止子引导表达 ,酸性α 淀粉酶自身信号肽序列引导分泌的表达元件 ,与黑曲霉糖化酶cDNA的表达元件同时插入由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIp型表达载体pWHY中 ,构成双基因表达分泌质粒pWAG。采用pWAG与酵母YEp型G4 1 8抗性表达质粒的共转化 ,将两个基因表达元件整合到酒精生产酵母菌株AS2 346的染色体rDNA序列中 ,获得同时表达胞外酸性α

电针对D-半乳糖致小鼠衰老模型海马突触蛋白的影响

电针D 半乳糖所致衰老模型小鼠的“百会”、“大椎”穴 ,并分别取其对照组、造模组和电针治疗组小鼠的海马 ,制备突触体总蛋白进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描分析。结果 :在D 半乳糖造模组海马有 4种蛋白的相对百分含量变化大于 2 0 % ,且均为降低。电针治疗组中以上 4种蛋白的相对百分含量和造模组相比均有所上升 ,接近对照组水平 ,其它蛋白的相对百分含量未发生显著改变。提示电针可能对D 半乳糖对小鼠海马突触蛋白的不良影响具有良性的调节作用。

细胞分化抑制因子(Id)研究进展

Id分子 (分化抑制因子 /DNA结合抑制因子 )是一组对碱性螺旋 环 螺旋 (bHLH)转录因子活性起负调节作用的转录因子 ,可抑制细胞分化 ,促进细胞增殖 .哺乳类动物细胞含Id1～Id4 4种Id因子 .该分子参与细胞周期调控过程 ,包括细胞发育、成熟、生长、分化以及死亡等 .自 1990年发现Id分子以来 ,有关该分子在基因表达调控、细胞增殖、分化、衰老和肿瘤发生等方面进行了广泛而深入的研究 .Id蛋白已成为研究细胞生命过程以及探寻治疗人类疾病有效靶向药物的一类重要分子 .

rhM-CSF对化疗小鼠抗白念珠菌感染的实验研究

人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是一种能刺激巨噬细胞系细胞生长、增殖、分化的生长因子,其抗真菌活性越来越受到重视.利用小鼠化疗损伤模型研究家蚕表达的重组人巨噬细胞集落刺激因子(rhM-CSF)单独或与氟康唑联合应用时对白念珠菌感染的防治作用.一次性腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,导致小鼠免疫功能下降.当小鼠外周血白细胞数降至最低时尾静脉注射白念珠菌.rhM-CSF治疗组分别采用每天10、50、250、500μg/kg4种剂量连续6d氟康唑每天300μg/kg,连续5d.记录各组小鼠的死亡天数和只数,计算平均存活天数和存活率.结果:rhM-CSF及rhM-CSF和氟康唑联合治疗组的小鼠存活率较空白组显著提高.250μg/kgrhM-CSF和氟康唑联合治疗组效果最好,小鼠存活率由空白组的14.3％提高至50.0％,存活小鼠肾脏白念珠菌菌落数也明显降低.表明家蚕表达的rhM-CSF对化疗损伤小鼠白念菌感染有明显的防治作用.为临床免疫功能低下病人感染白念珠菌的治疗提供了一种有效的新药.

MTT比色法在检测重组人GM-CSF生物活性中的应用

探索了ＭＴＴ比色法的一系列实验条件，并利用ＧＭ－ＣＳＦ依赖细胞株ＴＦ－１，测定了家蚕基因工程生产的重组人ＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）的生物活性，并与半固体培养集落刺激法进行了比较。

MTT比色法和ELISA方法检测重组人rhM-CSF的活性

应用家蚕幼虫表达的重组人巨噬细胞集落刺激因子 (rhM CSF)为材料 ,探索了MTT比色法和ELISA方法测定rhM CSF活性的最佳实验条件 ,并将这两种方法测定rhM CSF精品、粗品和原料的结果与软琼脂集落刺激法所得结果进行了比较 .结果表明 :MTT比色法灵敏度较高 ,结果稳定可靠 ,周期较短 ,可用于批量检测和精确定量 .ELISA方法简便快捷 ,特异性高 ,适用于大批量检测 .可根据不同检测要求选择不同的检测方法 ,为rhM CSF的质量检控和临床分析研究提供了较为切实可行的检测手段 .

重组人干细胞因子在昆虫细胞中的高效表达

含信号肽的可溶性人干细胞因子（ｈＳＣＦ）ｃＤＮＡ 基因重组于杆状病毒转移载体ｐＶＬ９４１ 中，重组转移载体ｐＶＬ９４１ＳＣＦ与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ 共转染草地夜蛾细胞Ｓｆ９ 后，通过体内同源重组构建了重组病毒ＡｃＮＰＶＳＣＦ。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交表明重组病毒基因组中含有ｈＳＣＦ基因片段。重组病毒感染单层Ｓｆ９ 细胞后，表达产物分泌到胞外培养液中。用ＭＴＴ 比色法和ＴＦ１ 细胞株测定表达产物与ＩＬ３ 的协同效应，测得感染重组病毒的培养细胞第三天表达量为１９７０ ｕｎｉｔｓ／ｍ Ｌ培养液。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析可见分子量为１８ ×１０３ 、２０ ×１０３ 和２２ ×１０３ 三条带。

利用分子标记研究小麦遗传群体的赤霉病抗性鉴定方法

针对小麦赤霉病抗源苏麦3号构建的两个小麦重组自交系遗传群体苏麦3号/Alondra和苏麦3号/安农8455,采用单花接种、表土接种及自然发病3种不同的接种方法进行小麦赤霉病抗性接种鉴定,并根据苏麦3号赤霉病抗性主效QTL的连锁分子标记Xgwm493和Xgwm533.1分别对群体进行抗性连锁分析.检测结果表明,在温室单花接种所获得的鉴定数据中,标记的赤霉病抗性连锁效应最高,P值分别小于0.0001,抗性鉴定结果最为准确.研究表明,对小麦赤霉病这种由数量性状控制,受外界环境影响较大的真菌病害进行抗扩展性的遗传研究,应采用控温控湿条件下的单花滴注接种鉴定方法最为合适.

腺病毒载体纯化及在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒是一种线性无包膜的双链DNA病毒,用于载体构建的主要是人类2型和5型腺病毒。现在通过对腺病毒的改造,已经成功构建出第一代、第二代、第三代和条件复制型腺病毒载体。随着腺病毒载体在蛋白质表达中的广泛使用,对高产量、高纯度腺病毒载体的需求量逐渐增大,因此近年来在传统纯化腺病毒载体的基础上发展出各种纯化新方法。同时,由于腺病毒载体自身的一些优点,使其在疫苗和肿瘤基因治疗中也得到了较为广泛的应用。

家蚕系统表达的重组人丁酰胆碱酯酶的生化性质

研究家蚕系统中高效表达的重组人丁酰胆碱酯酶(rhBChE)的生化性质并与天然人丁酰胆碱酯酶(nhBChE)进行比较。采用丁酰胆碱酯酶活性测定,抑制剂及重活化剂作用,免疫印迹等方法。实验结果表明,rhBChE及nhBChE在底物亲和力、抑制剂敏感性及可重活化性、稳定性、对抗体的反应性等方面均有相似的生化性质,重组人丁酰胆碱酯酶具有天然人丁酰胆碱酯酶的功能。但rhBChE的糖基化修饰程度较低。

Q型人血清对氧磷酶在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达

目的 研究对氧磷酶与心血管疾病的关系。方法 采用BAC TO BAC杆状病毒系统表达Q型人血清对氧磷酶 (PON 1) ,在已获得人PON 1全长cDNA的基础上 ,通过PCR扩增 ,得到上游含EcoRⅠ酶切位点 ,下游不含终止密码子而含HindⅢ酶切位点的PON 1基因 ,将其克隆到带有 6×His·Tag的pFASTBACⅡCD14质粒中 ,构建杆状病毒转移载体pFASTBACⅡ PON 1。将含有PON 1基因的重组质粒pFASTBACⅡ PON 1转化DH10BAC感受态细胞 ,使目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中。PCR鉴定正确后再转染入sf9昆虫细胞中 ,产生有感染力的重组杆状病毒。用乙酸苯酯为底物测定表达上清液中的酶活性。结果 比较不同感染复数(MOI)和不同感染时间PON 1在培养上清液中的表达情况 ,确定感染复数MOI为 6～ 8,感染时间 96～10 8h为PON 1的最佳表达条件 ,产率约为 4 .5mg·L- 1上清液。免疫印迹法表明重组蛋白有与抗 6×His单克隆抗体结合的抗原性。顺磁共振实验证明 ,基因工程产人重组血清对氧磷酶rhPON 1能有效清除Fe2 +诱导亚油酸脂质过氧化产生的脂质自由基 ,清除率为 5 5 .9%。结论 BAC TO

阿拉拉特小麦染色体的C-带和N-带分析

应用C 分带和N 分带技术对阿拉拉特小麦 (TriticumararaticumJakubz ,2n =2 8,AbAbGG)的根尖细胞进行染色体构成分析 ,结果表明 :(1)C 分带和N 分带方法均可以使阿拉拉特小麦染色体显示稳定的带型 ;(2 )根据带型可以明确区分阿拉拉特小麦各条染色体 ;(3)阿拉拉特小麦A、G组染色体带型与普通小麦A、B组染色体带型差异明显 ,利用分带方法可以区分阿拉拉特小麦与普通小麦的染色体 .

人分化抑制因子3重组腺病毒的制备及鉴定

目的构建人细胞分化抑制因子3(Id3)重组腺病毒载体,制备并鉴定人Id3重组腺病毒,为研究Id3基因在细胞中的表达及其对细胞功能的影响奠定基础。方法以pUC57-Id3为模板扩增人Id3基因,克隆到质粒pUC18中,pUC18-Id3经EcoR I和HindⅢ双酶切补平之后与载体pAxCAwtit连接,构建重组粘粒载体pAxCAwtit-Id3,包装试剂盒包装重组粘粒,转染大肠埃希菌,鉴定正确后大量制备重组pAxCAwtit-Id3,经酶切线性化后,用脂质体法转染HEK293A细胞,包装成重组腺病毒Ad-Id3,制备高滴度的重组腺病毒Ad-Id3,利用TCID50法计算重组腺病毒滴度,经RT-PCR及western blot检测Id3基因的表达。结果Id3基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.8×1010PFU/ml,用RT-PCR检测到Id3基因的转录产物,westernblot检测到Id3在A549细胞中的高水平表达。结论成功构建Ad-Id3重组腺病毒载体,并在A549细胞中得到高效表达。

CD40配体诱导小鼠B淋巴瘤细胞分化抑制因子3下调表达的研究

目的：研究CD40配体（CD40L）对小鼠未成熟B淋巴瘤细胞（WEHI-231细胞）分化抑制因子3（Id3）表达的影响。方法：用RT-PCR技术从WEHI-231细胞总RNA中扩增小鼠Id3（mid3）cDNA，将其亚克隆至p3FLAG-CMV-10载体；以p3FLAG-Id3-CMV-10为模板，用PCR扩增3FLAG—Id3融合基因，将其亚克隆至逆转录病毒载体pMX—CITE／IRES—EGFP中；通过脂质体转染技术将重组逆转录病毒载体（pMX-3FLAG—Id3-EGFP）转染Phoenix-ecotropic包装细胞系；将pMX-3FLAG-Id3-EGFP逆转录病毒转导WEHI-231细胞，转导48h后的WEHI-231细胞与CD40L／NIH333和NIH333细胞共培养24～48h。转导细胞经有限稀释法建立ndd3基因稳定转染细胞系。mlar3基因稳定转染细胞与CD40L／NIH333和NIH333细胞共培养24h后，用Western blot法检测3FLAG-mid3融合蛋白的表达。结果：pMX-3FLAG-Id3-EGFP转导WEHI-231细胞后，EGFP阳性细胞比例随时间呈下降趋势；单独用培养液培养或与NIH333细胞共培养的pMX-3FLAG-Id3-EGFP／WEH1-231细胞，24～48h后，EGFP阳性细胞率呈逐渐下降趋势；而与CD40L／NIH333细胞共培养的pMX-3FLAG-Id3-EGFP／WEHI231细胞，EGFP阳性细胞率基本保持不变。稳定表达3FLAG-Id3融合蛋白的WEHI-231细胞与CD40L／NIH313和NIH333细胞共培养24h后，Western blot结果显示，CD40L刺激可明显抑制3FLAG—Id3-EGFP／WEHI-231中Id3的表达。结论：CD40L可能通过对Id3的降解而缓解Id3诱导的细胞生长抑制作用。

人脐血造血干/祖细胞体外扩增的实验研究

探索脐血造血干 /祖细胞体外扩增的最佳条件 ;初步验证以单个核细胞作为培养起始细胞的可行性 .以脐血单个核细胞作为培养起始细胞 ,在IMDM培养基中加入不同的细胞因子组合培养 7d ,流式细胞仪测定培养前后的CD34+细胞百分数、CD34+CD38- 细胞百分数 ,分别计算单个核细胞 ,CD34+细胞和CD34+CD38- 细胞的增长倍数 .培养 7d后 ,对照及各组合中脐血单个核细胞总数均比扩增前有十分显著的增加 ,但各组合相互之间扩增倍数差异不显著 .CD34+细胞总数均比扩增前有十分显著的增加 ,加入SCF使扩增倍数增加更明显 .未加入SCF的组合中CD34+CD38- 细胞总数与培养前相比无明显增长 ,相对于对照扩增倍数也无明显差异 ;而加入SCF的组合相对于对照则有明显扩增 .以上结果证实以单个核细胞作为培养的起始细胞也能达到较好的扩增效果 .在本实验所用的细胞因子组合中 ,以SCF +IL 1+IL 3+IL 6 +GM CSF +EPO效果最佳 .昆虫细胞基因工程生产的rhSCF及人尿来源的L TPO对细胞扩增具有刺激作用 。

家蚕血淋巴液中重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的制备纯化及鉴定

为探索适于昆虫表达体系重组蛋白质的分离、纯化方法，对家蚕细胞表达的重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的纯化工艺进行了研究。利用离子交换色谱、凝胶过滤色谱及旋转等电聚焦电泳等技术，建立了从家蚕血淋巴液中分离、纯化ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的工艺路线。经过三步分离，获得了纯度为９７．２４％的目标产品，总回收率达３３．５９％。此法可有效地去除动、植物色素且简单、经济、高效，适于进行规模放大，为ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的大规模制备及临床应用打下了基础。

蛋白质感染颗粒与二价铜离子

蛋白质感染颗粒 (PrP)的错误折叠被认为是引起一些神经退化性疾病的主因 ,但其正常构象 (PrPC)的功能却一直不为人所知 .近年来研究发现 ,在正常细胞中 ,尤其是脑细胞中 ,细胞膜PrPC 可通过内吞作用进入细胞质而将Cu2 + 载运至SOD1,从而参与调节SOD1的活性及细胞铜代谢 .另有研究表明 ,Cu2 + 对于PrPSc (错误构象 )的蛋白水解酶K抗性的恢复及不同“病株”

基因工程人丁酰胆碱酯酶的纯化及其在体外对琥珀酰胆碱的解毒作用

目的：开发丰富又安全的人丁酰胆碱酯酶来源，并检测其解毒效率。方法：家蚕血淋巴液中重组人丁酰胆碱酯酶（rhBChE)的纯化采用批量硫酸铵分段分离和普鲁卡因酰胺－脂糖凝胶4B亲和层析技术。结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的rhBChE从血淋巴液中的总收率为66％，酶比活性达715mmol·min^-1·g^-1蛋白。rhBChE在－20℃含20％甘油及0．02％ NaN3的10mmol·L^-1磷酸盐缓冲液（pH7.4)中存放1年，酶活性无明显变化。18只小鼠ip事先与rhBChE孵温的1．5LD的琥珀酰胆碱，不出现任何中毒症状和体征，全部存活；而琥珀酰胆碱对照组，18只小鼠均剧烈抽搐并在2－5min内窒息死亡。结果：实验结果说明，从感染家蚕幼虫血淋巴液中纯化rhBChE的方法可靠，基因工程rhBChE在琥珀酰胆碱中毒危象的治疗中有潜在应用前景。

人M-CSF与SCF融合蛋白的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用重组DNA技术构建M CSF与SCF的融合基因并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体 pVL13 92中 ,通过与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)DNA共转染草地夜蛾细胞Sf9,融合基因插入AcNPV基因组。重组病毒感染单层Sf9细胞后 ,表达产物分泌到胞外培养液中 ,用MTT比色法和TF 1细胞株可检测到表达产物与IL 3的协同效应。