LPS诱导B淋巴细胞分化过程中部分基因表达的改变

LPS为1型T非依赖性抗原,可以在没有其他细胞辅助的情况下直接刺激成熟B淋巴细胞的增殖和分化并产生抗体。为了研究LPS诱导B淋巴细胞增殖和分化的调控机制,本研究检测了一些关键蛋白分子及转录因子表达的改变。LPS诱导的原代B淋巴细胞的分化伴随着B淋巴细胞抗原受体(BCR)信号转导相关分子表达的显著降低,说明BCR的功能在浆细胞阶段已处于次要的地位。我们的结果还证明,LPS可以在原代B淋巴细胞有效地诱导被称为“B淋巴细胞终极分化主调控子”的转录因子Blimp-1的表达,并抑制转录因子Bcl-6和BSAP的表达,这一变化同B淋巴细胞的发育同步,可能在诱导增殖与分化的调控中起着关键作用。

土建工程施工的现场技术管理核心探寻

近年来,随着城市化建设的不断发展,土建工程起到的作用越发突出。土建工程施工是以技术应用为核心,强化管理为根本,特别是现场技术管理占据着重要地位。土建工程施工现场技术管理是一项综合性、复杂性比较强的工作,且施工阶段很容易出现突发情况,所以需要制定科学有效的管理措施,充分发挥制度约束功能,从而保证土建工程有序施工。

B淋巴细胞信号转导相关接头蛋白Bam32与Hic-5的相互作用

32kDB淋巴细胞接头分子(Bam32)是调控B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导通路的关键蛋白质分子之一.为了研究Bam32的功能及其作用机理,应用酵母双杂交技术筛选了能与Bam32相互作用的蛋白质分子.筛选发现1个呈强阳性反应的克隆,其基因编码Hic5,为paxillin蛋白家族成员之一.Paxillin是整合素(integrin)信号转导通路中的关键蛋白质分子,而整合素在细胞对细胞外基质分子的粘附、细胞运动等方面起了重要的作用,因此对Bam32与Hic5的相互作用进行了进一步研究.用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Hic5共沉淀,证明它们可以在细胞内相互作用.应用免疫共沉淀法和抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,激酶Lyn可导致Bam32和Hic5的磷酸化.这些研究结果提示,Bam32与Hic5的相互作用可能在激活下游分子的信号转导级联反应以及调节细胞的粘附和运动等功能中发挥了重要的作用.

RNA干扰文库及其在功能基因组学研究中的应用

随着人类基因组大规模测序的完成,下一步的挑战是了解每一个基因的功能. RNA干扰文库为大规模基因功能筛选提供了可能. 虽然用于线虫等模式生物的RNAi文库,已经证明是大规模基因功能筛选的有效方法,但这些文库不能用于高等动物的细胞. 自2003年以来,用于人的细胞和哺乳动物细胞的RNAi文库取得了突破,相继出现构建已知基因RNAi文库和构建随机RNAi文库的报道,并成功地应用于大规模基因功能的筛选. RNAi文库作为一种简单、高效、大规模、高通量的功能基因组学研究的工具,将在基因功能研究、发现新的药物靶基因、发现疾病相关基因等方面有广阔的应用前景.

浆细胞发育基因表达谱的建立及部分基因表达的调控

目的 研究浆细胞发育过程中基因表达的改变及其调控。方法 应用基因芯片和RT PCR的方法研究成熟B淋巴细胞到浆细胞发育过程中基因表达的变化。结果 建立了浆细胞发育的基因表达谱 ,证实在浆细胞发育阶段一些重要的B细胞抗原受体 (BCR)信号转导相关分子 ,包括Igα、Igβ、Lyn、Syk、BLNK、SWAP 70、SHP 1的表达显著下降。转录因子BSAP可能同这些分子表达的调控相关。

与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定

目的:研究接头蛋白(adaptorprotein)Bam32在B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导级联反应中的作用。方法:以Bam32全序列为诱饵,应用酵母双杂交技术筛选能与Bam32相互作用的蛋白分子,并用293T细胞共转染和免疫共沉淀法加以证实。结果:应用酵母双杂交技术筛选出能与Bam32相互作用的蛋白分子,其中1个出现强阳性反应的克隆编码酪氨酸激酶Lyn。用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Lyn共沉淀。应用抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,Bam32与Lyn相互作用可导致Bam32磷酸化。结论:Bam32可同Lyn相互作用,导致Bam32磷酸化,这在激活下游产物的级联反应中可能起重要作用。

结核病免疫治疗研究进展

结核是导致死亡人数最多的传染病之一。据世界卫生组织（WHO）的统计，2007年全世界有近1000万活动性结核病患者，其中超过400万为痰菌阳性，有近180万人死于结核病。我国卫生部门公布的数据显示，我国大约有450万结核病患者，发病人数在所有传染病中位居第一位，每年大约有13万人死于该病。艾滋病加剧了结核病的流行，在非洲，有高达50％的艾滋病病人患有活动性结核。

抑制MTM1表达促进胚胎干细胞分化

应用随机RNAi文库,筛选了与胚胎干细胞自我更新和分化调控相关基因,发现了多个阳性候选基因,对其中的1个阳性候选基因肌管素1(myotubularin,MTM1)基因进行了深入研究.MTM1是属于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)蛋白家族的蛋白,其基因突变导致肌管性肌病.MTM1在胚胎干细胞中的功能到目前为止还不清楚.研究证实,MTM1在小鼠胚胎干细胞系CCE和R1均有表达.应用RNA干扰及集落形成实验证明,MTM1表达抑制后,处于自我更新状况胚胎干细胞集落的比例显著增加,提示MTM1在胚胎干细胞自我更新和分化的调控中起了重要的作用.

肠道螺旋体对肠上皮细胞的吸附及其特性的研究

目的 研究肠道螺旋体对肠上皮细胞吸附的特性。方法 利用人工培养的肠上皮细胞系H40 7细胞建立研究肠道螺旋体与肠上皮细胞相互作用的方法 ,并用该方法研究肠道螺旋体对肠上皮细胞吸附的特性。结果 4种不同来源的肠道螺旋体分离株均能吸附到人肠上皮细胞系H40 7细胞的表面 ,其中以人的分离株SP16的吸附率为最高 ,而非致病性的BrachyspirainnocensB2 5 6株则没有明显的吸附。人分离株SP16与H40 7细胞共同孵育 1h后的吸附率为 63 .77% ,2h则达到 89.11%。H40 7细胞经固定后肠道螺旋体仍能有效地吸附到细胞上 ,显示受体是稳定表达在肠上皮细胞的表面。结论 利用人工培养的肠上皮细胞系H40 7细胞建立了研究肠道螺旋体与肠上皮细胞相互作用的体外模型。

立克次体空斑技术

立克次体空斑技术及其应用近年来取得了不少进展。本文简要介绍立克次体空斑和空斑减数技术的方法,各种立克次体空斑的特点和空斑形成的影响因素。目前立克次体空斑技术已成功地应用于立克次体的定量测定、分类、克隆化、病原体分离、抗生素敏感性试验和致病机理的研究。

肺结核患者CD4^+记忆T细胞亚群的检测分析

目的:研究肺结核患者外周血总CD4+记忆T细胞及抗原特异性记忆T细胞的产生及分布规律,了解记忆T细胞在结核发病中的作用。方法:以荧光标记的抗CD4、CCR7、CD45RA3种抗体共染色,用流式细胞仪检测肺结核患者外周血总CD4+记忆T细胞;以荧光标记的抗人CD4、CD154、CCR7、CD45RA4种抗体共染色,检测结核抗原特异性CD4+记忆T细胞。通过对比分析,了解记忆T细胞分布特征。结果:肺结核患者外周血总CD4+T细胞中CD45RA+CCR7+T细胞、CD45RA-CCR7+T细胞和CD45RA-CCR7-T细胞这三群的比例分别为(59.18±16.11)%、(15.40±6.48)%和(16.30±9.97)%;而在抗原特异性CD4+T细胞中三群T细胞的比例分别为(32.67±13.94)%、(56.96±12.70)%和(8.76±5.62)%。通过统计学比较后发现,总CD4+T细胞和抗原特异性CD4+T细胞这两组之间CD45RA+CCR7+T细胞、CD45RA-CCR7+T细胞和CD45RA-CCR7-T细胞的分布比例差异均有显著性。结论:肺结核患者外周血总CD4+T细胞中以初始细胞为主,而抗原特异性CD4+T细胞中则以中央记忆细胞为主,说明结核病患者可以产生抗原特异性记忆T细胞,参与长效免疫,可能在防止再感染或者降低再感染的严重程度方面起重要作用。

U6和H1双启动子载体用于RNAi的实验研究

为建立一条简便、有效的构建哺乳动物细胞随机RNAi文库技术路线 ,首先通过PCR将 1 9～ 2 1ntsiRNA编码序列及终止信号等元件引入U6启动子下游 ,再将该扩增产物定向克隆至H1启动子的下游。构建的双启动子载体中 ,U6和H1相对排列 ,均以其间插入的靶序列为模板 ,分别转录出其正义和反义链 ,形成功能性siRNA。以EGFP和bcl 2为靶基因的实验表明 ,该方法构建的载体可有效地干扰相应基因的表达。

应用载体介导的RNAi技术抑制Bcl-2的表达

目的 应用载体介导的RNAi技术特异地干扰抗凋亡基因bcl 2在HeLa细胞中的表达。方法 构建利用H1启动子转录功能性siRNA的载体 ;在H1启动子下游分别插入含不同bcl 2基因特异性序列的 64nt寡核苷酸片段 ;将构建的质粒转染HeLa细胞 ,以间接免疫荧光和免疫印迹检测转染后细胞中Bcl 2的表达水平。结果 3种含不同bcl 2特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在细胞中的表达 ,但干扰的效果存在差异 ,从 45 %～ 83 5 %。结论 本研究建立的载体介导的RNAi技术可成功地用于干扰Bcl

结核分枝杆菌特异性抗原反应性因子对活动性肺结核的鉴别诊断意义

目的研究活动性肺结核和细菌性肺炎及原发性支气管肺癌患者的外周血单个核细胞（PBMCs）经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后的多因子表达特点及诊断意义。方法 100例初治活动性肺结核患者,35例细菌性肺炎和原发性支气管肺癌患者,分离外周血单个核细胞（PBMCs）,用结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激,采用FlowCytomix流式技术检测细胞培养液上清上中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IP-10（CXCL10）和MIG（CXCL9）的表达,用接受者工作特征曲线（ROC curve）评价以上结核分枝杆菌抗原特异反应性因子的诊断价值。结果 PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后,培养液上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IP-10和MIG水平显著升高,初治活动性肺结核患者与其他肺病对照组差别显著（中位值分别为595.0/0.0 pg/ml,338.0/48.6 pg/ml,226.0/0.0 pg/ml,3 865.0/297.0 pg/ml,3541.0/81.1 pg/ml;P值均〈0.000 1）,ROC曲线下面积（95%CI）分别为0.917 1（0.862 9~0.971 4）,0.807 0（0.724 6~0.889 4）,0.854 9（0.785 5~0.924 2）,0.920 0（0.870 8~0.969 2）,0.936 3（0.894 4~0.978 1）,IFN-γ诊断特异性为94.3%,联合IP-10诊断提高敏感性至92.1%。结论结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激外周血单个核细胞产生的MIG、IP-10和IFN-γ能够良好的鉴别初治活动性肺结核及常见的细菌性肺炎和原发性支气管肺癌,可能成为新的诊断指标。

IGRA检测在结核性胸膜炎中的诊断价值

目的评价γ干扰素释放试验在结核性胸膜炎患者中的诊断价值。方法选取入住本院的116例可疑结核性胸膜炎(tuberculous pleurisy,TBP)患者,同时采集全血和胸水进行T-SPOT.TB检测,利用结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10与全血和胸水细胞共同培养,按说明判读检测结果。结果 116例可疑结核性胸膜炎患者中有91例被确诊为活动性结核感染,25例排除结核感染。全血细胞诊断TBP的敏感性是79.1%,特异性是64.0%。胸水细胞诊断TBP的敏感性是90.1%,特异性是88.0%。两组患者比较TSPOT.TB阳性率有显著差异(P<0.001)。联合全血和胸水细胞T-SPOT.TB结果阳性预测值等于100%(72/72),阴性预测值等于94.1%(16/17)。结论采集胸水细胞进行T-SPOT.TB检测对诊断TBP具有可行性,联合全血和胸水进行T-SPOT.TB检测对于TBP的诊断意义会更大。

初治菌阳肺结核患者外周血NK细胞比例显著下降

目的研究活动性肺结核患者外周血淋巴细胞群内NK细胞比例及自发凋亡率特点。方法初治菌阳肺结核患者和体检健康的正常对照各20例,年龄和性别无显著差异,密度梯度离心分离PBMCs,用流式细胞仪分析CD3-CD16+CD56dimNK细胞和CD3-CD56highNK细胞在淋巴细胞群的比例,培养24 h后用Annexin V-PI方法流式细胞术检测自发凋亡率。结果初治菌阳肺结核患者外周血NK细胞比例显著下降,CD3-CD16+CD56dimNK细胞比例下降尤为显著(P<0.000 1),其自发凋亡率显著升高(P<0.000 1)。结论初治菌阳肺结核患者体内具有细胞毒功能的NK细胞比例显著下降,对抗结核分枝杆菌活化的力量被消减。NK细胞自发凋亡率显著升高可能是其比例下降的原因之一,但其机制及与结核免疫的关系尚需进一步研究。

慢病毒携带shRNA对宫颈癌细胞中HPV16型E6表达的抑制作用

目的研究慢病毒携带的短发夹状干扰RNA(short hairp in RNA,shRNA)对宫颈癌Cask i细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap illom a virus,HPV)16型E6表达的抑制作用。方法将靶向HPV16型E6的shRNA表达序列克隆到改建的慢病毒表达载体PLL3.7中,经限制性酶切鉴定和测序后,与3种包装质粒混合,以L ipofectam ine 2000包裹后转染293FT细胞,72 h后收取含病毒的上清液并感染宫颈癌Cask i细胞,感染48 h后加入G418筛选阳性克隆。每天对阳性细胞克隆进行细胞计数;提取细胞总mRNA,进行RT-PCR反应。结果与对照组相比HPV16型E6的表达降低70%,宫颈癌Cask i细胞生长速度减慢50%。结论慢病毒携带的短发夹状干扰RNA能干扰宫颈癌细胞中HPV16型E6的表达并有抑制癌细胞生长的作用。

结核性胸膜炎患者MAIT细胞Granzyme B免疫应答特征及其与疾病转归的相关性

目的研究结核性胸膜炎患者胸腔积液中MAIT细胞颗粒酶B(Granzyme B)免疫应答特征及其与疾病转归的相关性。方法提取25份结核性胸腔积液PFMCs,用结核分枝杆菌H37Rv裂解液刺激后收集细胞,进行流式抗体染色。另外有10例患者重复收集胸水,其中7例治疗效果好,胸水吸收,另3例无明显治疗效果,比较其治疗前后Granzyme B^+MAIT细胞比例。结果结核分枝杆菌抗原刺激后,结核性胸膜炎患者胸腔积液中Granzyme B^+MAIT比例为(25.34±5.37)%。男女性和不同年龄患者的Granzyme B^+MAIT细胞比例均差异无统计学意义。7例治疗效果好的患者治疗后Granzyme B^+MAIT细胞比例明显上升,治疗前后比例分别为(30.41±2.78)%和(40.61±2.61)%,差异有统计学意义(t=9.867,P <0.000 1)。3例治疗效果不好的患者Granzyme B^+MAIT细胞比例明显低于治疗效果好的患者,且治疗后比例上升不明显。结论 MAIT细胞生成颗粒酶B通过细胞毒性杀伤作用而在局部抗结核免疫中发挥重要作用。

活动性结核病人PBMCs中转录因子PLZF的表达降低与iNKT细胞的减少相关

目的:比较活动性结核病人和健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中转录因子PLZF(Promyelocytic leukemiazinc finger)的表达和iNKT细胞含量的差异,研究活动性结核病人PBMCs中PLZF的表达与iNKT细胞含量的相关性。方法:采集活动性结核病人和健康人新鲜的抗凝血,淋巴细胞分离液分离PBMCs。每个样本的PBMCs分两份,一份细胞用Trizol法提取总RNA,荧光定量PCR检测PLZF mRNA的相对表达量;另一份细胞用特异性抗体标记iNKT细胞,流式细胞仪检测iNKT细胞的含量。统计学软件分析两组样本PLZF的表达和iNKT细胞含量的差异,以及PLZF的表达与iNKT细胞含量的相关性。结果:活动性结核病人PMBCs中PLZF的表达和iNKT细胞含量均显著低于健康对照(P值分别为0.010 2和0.001 2),PLZF的表达与iNKT细胞的含量成正相关(r=0.480 4,P=0.027 5)。结论:活动性结核病人PLZF的表达降低与iNKT细胞百分含量的减少相关。