DNA损伤修复相关通路的合成致死靶点研究及其在卵巢癌中的应用和前景

DNA损伤引发细胞启动一系列DNA损伤应答(DNA damage response,DDR),包括DNA损伤修复、细胞周期检查点激活、细胞周期阻滞、各种细胞内信号转导途径的活化和细胞凋亡等。DNA损伤修复(DNA damage repair)是细胞维持基因组稳定性的重要机制,于2015年获得诺贝尔化学奖。DNA损伤修复途径主要包括:碱基切除修复(base-excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)、错配修复(mismatch repair,MMR)、同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)等,分别在DNA单链断裂(single-strand break,SSB)或双链断裂(double-strand break,DSB)等损伤修复中发挥重要作用。DNA损伤修复缺陷与肿瘤发生发展密切相关,同时也是肿瘤治疗的重要靶点。DNA损伤修复通路的多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)与乳腺癌易感基因BRCA 1/2等存在合成致死(synthetic lethality)作用,使PARP抑制剂(PARP inhibitor,PARPi)成为第一个也是目前唯一上市的肿瘤治疗合成致死靶药。PARPi在卵巢癌及多种实体瘤治疗中疗效良好,使DNA损伤修复及相关DDR通路的合成致死靶药研发成为热点,其他在研靶点主要包括:共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein,ATM)、共济失调毛细血管扩张与RAD3相关蛋白(ataxia telangiectasia and Rad3 related protein,ATR)、DNA依赖性蛋白质激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase1,CHK1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,CHK2)、阻止有丝分裂的蛋白质激酶WEE1等。PARPi与其他DDR靶药、抗血管生成药物及免疫检查点抑制剂的联用,有可能成为克服PARPi耐药、提高疗效的有效手段和发展前景。本文针对DNA损伤修复及相关DDR通路的关键分子和潜在肿瘤治疗靶点进行综述,阐述了DNA损伤修复相关通路的合成致死靶点研究及在卵巢癌的应用和前景,为基础研究及临床应用提供指导。

血清人附睾分泌蛋白4(HE_4)和CA_(125)在卵巢癌患者手术及化疗前后的变化

目的检测卵巢癌患者手术及化疗前后HE4和CA125的血清值,探讨卵巢癌患者治疗前后HE4、CA125的变化情况。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测21例卵巢癌患者治疗过程中血清HE4和CA125水平。数据使用SPSS13.0进行统计学分析。结果卵巢癌患者术后行常规化疗,血清HE4及CA125的水平基本下降到正常。术前HE4中位数水平为796.32pmol/L,第2次后基本恢复正常,为135.61pmol/L;患者术前CA125中位数水平为1280kU/L,第3次化疗后为30.4kU/L,恢复正常。卵巢癌患者治疗过程中HE4与CA125具有较强的相关性,相关系数为0.811。结论 HE4可能作为有助于评判疗效的另一种血清学标志物。

抗癌药物阿霉素的荧光发射光谱分析

利用蒽环类抗癌药物阿霉素的自发荧光可反映药物在细胞中的分布和相对剂量；利用特异性荧光探针Hoechst33342(Ho．33342）可标记活细胞DNA，从而反映细胞所处周期时相及染色体的形态变化．但是在阿霉素和Ho．33342共存在的细胞中，用MPVⅡ型显微荧光分光光度计对药物的自发荧光和Ho．3342的发射荧光进行光谱分析的结果表明：在紫外激发下，药物自发荧光与Ho.33342荧光之间存在干扰；选择适合的外加带通滤片S525后，这种干扰可降低到可以忽略的程度，从而在同一细胞内可分离开2种荧光，并进行定量分析．该结论有利于今后发展影像分析和荧光多参数相关测量方法，可以通过荧光图像的获取及分析来研究单个活细胞摄取、滞留抗癌药物与细胞增殖、细胞凋亡及抗药性的关系，从而揭示药物的作用机理．

卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞183B2的无血清培养研究

目的 建立体外无血清培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法 ,并进行纯化工艺的探讨 ,为规模化抗体生产奠定基础。方法 以卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞 183B2为研究对象 ,通过与常规的有血清培养法比较 ,研究了无血清培养基H -SFM中杂交瘤细胞的生长特性、抗体分泌效率、活性 ,用Supper-Spinner搅拌瓶进行了放大培养并用ProteinA亲和层析法对无血清培养上清中抗体的纯化工艺进行了探索。结果 183B2能够直接适应无血清培养基 ,不需要驯化 ;抗体生成约 4d达到高峰 ,抗体产量可达 5 0mg/L/ 10 6个细胞 ,无血清培养基中细胞生长及单抗的产量与效价与有血清培养的相比没有明显差别。用 1LSupper-Spinner搅拌瓶无血清放大培养 183B2细胞成功 ,培养上清经ProteinA亲和层析纯化 ,蛋白产率约 10mg/L培养上清。结论 本研究初步成功探索了卵巢癌单克隆抗体细胞 183B2的无血清培养方法和抗体提纯工艺 ,为进一步大规模抗体生产提供了实验依据。

HL-60多药抗性细胞抗HT诱导凋亡机制的研究

用 1mg·L-1 三尖杉酯碱 (Harringtoning ,HT)处理人早幼粒急性白血病HL 6 0细胞2h ,诱导细胞出现明显的凋亡 (Apoptosis ,Apo)形态学和生化特征 ,包括染色质凝集、Caspase 3(天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白水解酶 3)活化、DNA断裂等 .来自HL 6 0的多药抗性细胞HR2 0和HT9抗HT诱导的凋亡 ,一般认为是P 糖蛋白 (P GP 170 )对药物的外排作用引起细胞对凋亡的抗性 .但用 2mg·L-1 CsA(CysclosporineA)逆转抗性细胞对药物的外排作用 ,1mg·L-1 HT作用 4 8h仍不能诱导HR2 0和HT9细胞凋亡 ,说明HR2 0和HT9多药抗性细胞抗HT诱导凋亡的机制不仅仅在于细胞膜上的P 糖蛋白对药物的外排作用 ,可能还有凋亡相关因子或其他因素参与作用 .Caspase 3是细胞凋亡通路中的一个中心环节 ,HR2 0和HT9抗HT诱导的Caspase 3活化 ,这可能是HR2 0和HT9不能凋亡的一个重要原因 .

环孢素A诱导多药耐药细胞HR20和HT9凋亡的方式

背景与目的:诱导细胞凋亡是许多化疗药物的作用机制,多药耐药细胞常可以抵抗药物诱导的凋亡,有必要从分子机理上探索其抗凋亡机制。但正是由于耐药细胞的抗凋亡特性,难以在凋亡通路中展开相关研究。本研究用环孢素A(CyclosporinA,CsA)诱导药物敏感的人急性白血病细胞HL-60及其多药耐药细胞HR20和HT9凋亡,通过对二者凋亡通路中的关键分子进行比较,分析耐药细胞与敏感细胞凋亡途径的差别。方法:用10、20mg/LCsA分别处理HL-60、HR20和HT9细胞,用细胞核形态观察、DNA凝胶电泳以及流式细胞术方法鉴定凋亡,通过分光光度法和免疫印迹法检测凋亡过程中相关因子的变化。结果:10、20mg/LCsA处理HL-60、HR20和HT9细胞,能够诱导细胞都发生明显的凋亡,包括染色质凝集、DNA片断化因子(DNAfragmentationfactor,DFF)裂解激活以及DNA断裂,然而仅在HL-60凋亡细胞中检测到Caspase-3活化,而在HR20和HT9凋亡细胞中Caspase-3没有活化。结论:CsA诱导HR20和HT9细胞凋亡的通路可能不依赖于Caspase-3,其凋亡通路中可能存在除Caspase-3以外的DFF活化因子。推测Caspase-3不容易活化可能是HR20和HT9多药耐药的原因之一。

新发现1例人卵巢上皮癌组织移植裸鼠形成的“端着丝粒染色体”恶性细胞系

目的按照常用肿瘤细胞建系方法,以人卵巢上皮癌组织移植免疫缺陷小鼠,通过原代培养建立永生化细胞系,为人体肿瘤的研究提供体外研究模型。方法将1例卵巢浆液性乳头状癌IIIcG3患者手术切除的肿瘤组织接种裸鼠皮下成瘤,通过体外原代培养,建立1株悬浮生长的细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、克隆形成实验、双层软琼脂培养、裸鼠接种等,对其生物学特性进行研究。结果该细胞系已传至100代以上,命名为WSZ。其生物学特性为:形态学观察细胞呈悬浮球形生长状态;细胞生长增殖旺盛,对数期细胞群体倍增时间约15.8h;染色体为16～135条,以68和69条染色体为多见,染色体分析显示,基本全部为端着丝粒染色体;细胞克隆形成率为89.3%,具有软琼脂集落形成能力;异种移植实验表明106细胞在裸鼠皮下可成瘤,而100个细胞接种非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠即可形成皮下肿瘤。结论 WSZ能够在体外长期生长和稳定传代,WSZ是一高度恶性的细胞系。

血清HE4和CA125联合检测预测盆腔包块患者卵巢癌的风险

目的:探讨新型肿瘤标记物人附睾分泌蛋白4(HE4)和CA125联合检测预测盆腔包块患者上皮性卵巢癌(EOC)风险的价值。方法:将诊断为盆腔包块拟行手术的患者纳入本研究。测定患者术前血清HE4和CA125水平,分别用绝经后和绝经前预测模型(ROMA)将患者划分至高危组和低危组,评估预测模型的应用价值。结果:评估了191例患者,其中138例盆腔良性疾病,53例盆腔恶性肿瘤,包括36例EOC。绝经后组盆腔良性疾病12例,8例划分至低危组,特异性66.7%(95%CI=40.0～93.3),恶性肿瘤37例,35例划分至高危组,敏感性94.6%(95%CI=87.0～101.9),EOC28例(含9例早期),全划分至高危组,敏感性100.0%。绝经前组良性疾病126例,103例划分至低危组,特异性81.7%(95%CI=75.0～88.5),16例恶性肿瘤,12例划分至高危组,敏感性75.0%(95%CI=54.0～96.2),EOC8例(含2例早期),全划分至高危组,敏感性100.0%。结论:ROMA成功地将盆腔恶性肿瘤患者划分至高危组,其中EOC患者全被正确地划分至高危组,可用于将恶性肿瘤患者尤其是EOC患者分流至有治疗经验的肿瘤医师及治疗中心。

卵巢癌特异性免疫细胞治疗的体内外实验研究

背景与目的:卵巢癌抗独特型微抗体(6B11mini)是部分人源化的抗独特型卵巢癌疫苗,体内外实验研究证明,它可以诱导出特异的抗卵巢癌体液免疫和细胞免疫。本研究评价将6B11mini作为抗原,采用免疫细胞的方法处理卵巢癌时的安全性和有效性。方法:用纯化的6B11mini负载树突细胞(dendritic cell,DC),与外周血单个核细胞(peripheral blood mononucleocyte,PBMNC)混合培养,在多种细胞因子共同作用下获得效应细胞6B11-OCIK。通过软琼脂克隆形成实验及接种裸鼠皮下瘤实验,观察6B11-OCIK在体内和体外的成瘤能力;将6B11-OCIK静脉注射BALB/c小鼠,观察急性毒性反应;体外Cr释放实验检测6B11-OCIK对靶细胞的杀伤作用。51用人卵巢癌细胞株SKOV3构建严重联合免疫缺陷(severe combined immune deficieney,SCID)小鼠卵巢癌移植瘤模型,注射6B11-OCIK,并以CIK、PBMNC细胞以及生理盐水作为对照组,分别观察各组肿瘤生长情况。结果:软琼脂培养14d,卵巢癌SKOV3细胞克隆形成良好,克隆形成率50%;皮下接种裸鼠后14d,阳性对照的宫颈癌HeLa细胞组全部成瘤,6B11-OCIK、CIK、WI-38组和新鲜PBMNC组持续观察13周没有成瘤。6B11-OCIK静脉注射BALB/c小鼠,30min内各剂量实验组和生理盐水对照组动物都无任何明显的不良反应;输注后第13天处死小鼠,解剖小鼠观察其各主要脏器无明显异常。在体外杀伤实验中6B11-OCIK对抗原阳性的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用,并且与MHC限制性相关;在荷瘤SCID小鼠中6B11-OCIK治疗组肿瘤重量与生理盐水对照组相比差异有统计学意义(P=0.023),与CIK组、新鲜单采组相比差异无统计学意义(P=0.540,P=0.285)。结论:6B11-OCIK在动物体内应用时符合安全性指标,并对卵巢癌的生长有一定的抑制作用。

肿瘤坏死因子受体相关蛋白1在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义

目的:验证并探讨肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptor associated protein 1,TRAP1)在上皮性卵巢癌中的表达及临床病理意义。方法:利用免疫组织化学和Real-time RT-PCR方法检测114例上皮性卵巢癌组织、50例卵巢良性肿瘤和38例卵巢正常上皮组织中TRAP1的表达。结果:免疫组织化学染色和RT-PCR结果显示,卵巢癌患者TRAP1蛋白和mRNA表达水平明显升高,与正常对照组、卵巢良性肿瘤组相比差异均有统计学意义(P<0.05),TRAP1蛋白和mRNA表达水平在卵巢癌的不同组织学类型间、不同病理分级间差异有统计学意义(P<0.05),而在不同年龄、不同FIGO分期、有无大网膜转移、有无淋巴结转移及不同腹水量间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:TRAP1在卵巢上皮性癌中呈高表达,提示TRAP1可能与上皮性卵巢癌的发生、发展有关。

抗卵巢癌单链免疫细胞因子真核表达载体的构建及表达

为将细胞因子IL 2靶向卵巢癌局部 ,提高肿瘤局部细胞因子的浓度 ,构建并表达了抗卵巢癌单链免疫细胞因子IL 2 1 83B2scFv .通过基因工程将两段基因IL 2和 1 83B2scFv开放读码框架的编码序列克隆在一起 ,在CHO细胞内人巨细胞病毒启动子的作用下表达可溶性融合蛋白 .酶联免疫吸附法检测其免疫学活性 ,并检测其促淋巴细胞增殖活性 .构建成功的抗体细胞因子融合蛋白能够在哺乳动物细胞内表达并能分泌到细胞外 ,且融合蛋白既能与卵巢癌相关抗原OC1 83B2很好地结合 ,又能刺激IL 2依赖细胞株的增殖 。

ROBO4在上皮性卵巢癌组织和血清中的表达及临床意义

目的探讨ROBO4在上皮性卵巢癌组织和血清中的表达及其在卵巢癌发生发展中的作用。方法采用免疫组织化学和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测110例卵巢癌,54例卵巢良性肿瘤,40例正常卵巢组织中ROBO4蛋白和ROBO4mRNA表达,比较其表达与卵巢癌临床病理特征的关系;并采用ELISA检测卵巢癌、卵巢良性肿瘤和正常人血清中ROBO4表达水平。结果卵巢癌组织中ROBO4蛋白和ROBO4mRNA表达显著低于正常对照组和卵巢良性肿瘤组(P<0.05);上皮性卵巢癌血清中ROBO4的表达明显低于卵巢良性肿瘤和正常人(P<0.05);卵巢癌组织中ROBO4表达降低与卵巢癌FIGO分期、淋巴结转移、大网膜转移和腹水相关(P<0.05);卵巢癌组织中ROBO4表达与年龄、组织学类型和病理分级无相关性。卵巢癌患者血清ROBO4、CA125的相关分析显示,两者之间无相关性。结论在卵巢癌发生过程中ROBO4表达降低起到重要作用,表达异常的ROBO4与卵巢癌的侵袭转移能力相关,并与卵巢癌的临床病理学特征有明显的相关性。

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠HSP70融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)融合蛋白6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。方法根据Genebank上已发表的mHSP70基因序列(NM_010478)合成引物行PCR扩增,以扩增所得mHSP70基因插入pET30a(+)-6B11ScFv质粒后转化入E.coliDH5α,获得pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70重组质粒。将鉴定正确的pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70重组质粒转化入E.coliBL21(DE3),获得E.coliBL21(DE3)[pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并行SDS-PAGE分析,对表达产物进行复性和Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和ELISA方法进行鉴定和免疫活性检测。结果6B11ScFv/mHSP70融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达20.9%,蛋白纯度达95%以上。蛋白质印迹分析证实6B11ScFv/mHSP70融合蛋白相对分子质量为104000,ELISA检测表明其具有6B11ScFv和mHSP70的免疫活性。结论构建表达的6B11ScFv/mHSP70融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。

卵巢早衰动物模型的建立

目的应用不同化疗药物建立卵巢早衰动物模型,探索有效的卵巢早衰动物模型建立方法。方法采用两种临床常用化疗药物紫杉醇、环磷酰胺诱导处理动情周期正常的雌性Wister大鼠,分为紫杉醇组与紫杉醇对照组、环磷酰胺组与环磷酰胺对照组。一段时间后观察大鼠一般生理情况,检测各组大鼠体重的变化,应用ELISA技术检测各组血清中E2、FSH的表达情况,同时比较各组卵巢组织形态、卵泡数的变化。结果环磷酰胺组较对照组,大鼠活动减少,体重下降,E2水平明显下降(P<0.05),FSH水平明显升高(P<0.05),卵巢结构萎缩,卵泡数明显减少。紫杉醇组与对照组大鼠相比,雌激素含量明显降低,活动量未见明显减少,体重均呈增加趋势,卵巢结构、卵巢长径、卵泡数以及促卵泡素均未见明显差别。结论环磷酰胺在建立卵巢早衰的动物模型中比紫杉醇具有优势,更适用于卵巢早衰相关研究。

抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3单链双特异抗体的构建和表达

目的 :构建和表达一种可与卵巢癌细胞和淋巴细胞结合的双特异抗体。方法 :利用PCR分别扩增抗人CD3单链抗体 (singlechainvariablefragment,ScFv)重链可变区 (variableregionoftheheavychain ,VH)和轻链可变区 (variableregionofthelightchain ,VL) ,重组抗人CD3ScFv ,经测序后将其克隆入有链间连接肽基因序列的载体pALM中 ,再将抗人卵巢癌COC183B2ScFv克隆至紧邻链间连接肽前形成COC183B2 /抗CD3单链双特异抗体(single-chainbispecificantibody ,scBsAb)的重组。最后将COC183B2 /抗CD3scBsAb克隆入表达载体 pTMFC中进行表达 ,同时分别表达抗人卵巢癌单抗COC183B2和抗人CD3单抗的ScFv作为对照组。用ELISA、流式细胞学方法和玫瑰花环实验对scBsAb进行免疫学活性测定。结果 :成功构建抗人卵巢癌COC183B2 /抗CD3scBsAb ;其表达的蛋白链相对分子质量约 6 0 ;ELISA结果显示scBsAb可与抗原OC183B2结合 ,流式细胞学结果显示scBsAb可与抗原CD3结合 ,花环实验显示scBsAb在体外可引导效应细胞聚集在靶细胞周围。结论 :构建和表达抗人卵巢癌COC183B2 /抗CD3scBsAb成功 ,且具有与抗原OC183B2。

卵巢癌抗独特型单链抗体3D_5ScFv的高效表达

对 3D5卵巢癌抗独特型单链抗体进行原核系统的高效表达 .采用DNA重组技术 ,将 3D5ScFv克隆到原核表达载体pTMF中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;IPTG诱导表达 ,SDS PAGE鉴定蛋白质的分子量约为 2 8kD ;通过直接ELISA、竞争抑制实验和Western印迹分别检测其活性 .3D5ScFv以包涵体的形式获得高效表达 ,占菌体总蛋白 36 % ,变性复性后蛋白的纯度大于 90 % ,表达蛋白能与卵巢癌抗体OC12 5特异性结合 ,并能有效抑制卵巢癌抗原CA 12 5与卵巢癌抗体OC 12 5的特异性的结合 .3D5ScFv在原核系统中获得了高效表达 ,并具有较好的活性 。

免疫球蛋白IgG在卵巢上皮性癌中的表达

目的探讨正常卵巢、卵巢良性肿瘤、卵巢上皮性癌中免疫球蛋白IgG的表达。方法采用免疫组化染色,应用兔抗人IgG多克隆抗体对42例卵巢上皮性癌、10例卵巢良性肿瘤、10例正常卵巢进行检测,并用计算机图像分析系统检测IgG的表达情况。结果上述三类组织中均存在不同程度的IgG表达,阳性表达基本定位于细胞浆。卵巢上皮性癌组织中IgG阳性表达的相对面积和平均光密度均显著高于正常卵巢(P<0.01),正常卵巢与卵巢良性肿瘤之间在阳性表达相对面积上有明显差异,在平均光密度比较中没有明显差异。结论卵巢上皮性癌中存在免疫球蛋白IgG的高表达。

抗体-白细胞介素2融合蛋白183B2scFv-Interleukin2的表达及活性检测

目的在哺乳动物细胞内表达抗体细胞因子融合蛋白183B2scFv Interleukin2,为卵巢癌提供一种新的治疗方法。方法通过基因工程的方法将两段基因IL2和183B2scFv开放读框的编码序列克隆在一起,在CHO K1细胞内人巨细胞病毒启动子的作用下表达可溶性融合蛋白,并检测其对肿瘤细胞的靶向性。结果采用哺乳动物细胞表达,系统表达的这种小分子融合蛋白,既保留了与卵巢癌OC183B2抗原结合的特性,又保持了IL2的生物学活性。融合蛋白在细胞培养上清中保持稳定,更重要的是融合蛋白将IL2靶向表达OC183B2抗原的卵巢癌细胞表面化的同时,又能刺激IL2依赖细胞株的增殖,从而诱发局部有效的抗肿瘤反应。既提高了融合蛋白的穿透组织能力和肿瘤组织部位的浓聚,又避免了大剂量全身应用细胞因子引起的副作用。结论真核表达系统表达的融合蛋白具有很好的生物学活性。

GPNMB在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义

目的探讨非转移性黑色素瘤糖蛋白B(GPNMB)在上皮性卵巢癌组织中的表达,及其与卵巢癌临床病理学特征的关系。方法采用免疫组织化学染色和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测116例卵巢癌、42例卵巢良性肿瘤和40例正常卵巢组织中GPNMB的表达。结果免疫组织化学染色和RT-PCR结果显示卵巢癌患者GPNMB表达水平明显升高,与正常对照组、卵巢良性肿瘤组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。GPNMB表达水平与卵巢癌的组织学类型相关(P<0.05),而与年龄、病理分级、FIGO分期、大网膜转移、淋巴转移及腹水量无相关性(P>0.05);结论卵巢癌患者中GPNMB明显升高,并与组织学类型相关,提示可能参与了卵巢癌的发病。

6B11ScFv-mHSP70融合蛋白诱导抗卵巢癌免疫应答的体外实验研究

目的既往研究证实,6B11抗独特型单链抗体(6B11ScFv)具有模拟卵巢癌相关抗原OC166-9的作用。本文研究6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)构建而成的融合蛋白(6B11ScFv-mHSP70)在体外抗卵巢癌免疫应答,探讨其作为卵巢癌疫苗的可能性。方法以大肠杆菌表达6B11ScFv-mHSP70融合蛋白,经变性复性后纯度达95%。采用ELISA检测其免疫学活性。采集HLA-A2阳性的女性健康志愿者的外周血单个核细胞,用6B11ScFv-mHSP70刺激并培养。采用CCK-8法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和对卵巢癌细胞系的细胞毒作用,流式细胞术检测6B11ScFv-mHSP70刺激前后淋巴细胞表型的改变。结果6B11ScFv-mHSP70具有特异性结合卵巢癌单抗COC166-9及抗小鼠-HSP70抗体的双重免疫学活性;可以刺激人外周血淋巴细胞的增殖;并对HLA-A2阳性、OC166-9表达阳性的卵巢癌细胞系有细胞毒作用;经6B11ScFv-mHSP70刺激后,实验组的淋巴细胞表型与未经蛋白刺激的对照组相比:CD4+T细胞明显增加,CD8+T细胞略有增加。CD4+/CD8+的比率明显增加,CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比率明显下降,差异有统计学意义。结论6B11ScFv-mHSP70融合蛋白在体外可诱导特异性抗卵巢癌的细胞免疫反应,有可能作为抗独特型疫苗用于卵巢癌的主动免疫。