重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

Eicosapentaenoic acid代谢产物促进胰岛α细胞转分化为胰岛β细胞的作用研究

目的 探讨eicosapentaenoic acid(EPA)代谢产物促进胰岛α细胞向β细胞转分化的作用。方法 雄性C57BL/6J小鼠连续5 d腹腔注射60 mg/kg链脲佐霉素(streptozocin, STZ)构建1型糖尿病(T1DM)小鼠模型,2周后随机分为模型组、97%EPA饮食干预组、75%鱼油(50%EPA+25%DHA)饮食干预组,每周检测随机血糖;模型到期后,通过免疫荧光染色观察小鼠胰腺中胰岛β细胞再生情况。提取tdTomato荧光蛋白特意标记α细胞的小鼠(GCGicre小鼠与Rosa26tdTomato小鼠杂交获得)胰岛,加入1 mmol·L^(-1)STZ诱导β细胞凋亡,添加EPA代谢产物,培养48 h后,利用荧光染色观察胰岛素和tdTomato荧光的表达。在小鼠胰岛α细胞系αTC1培养基中添加EPA代谢产物,48 h后,利用荧光染色观察胰岛素和胰高血糖素的表达。结果 EPA和鱼油饮食干预均可明显降低T1DM小鼠的血糖水平,改善葡萄糖稳态,且胰腺中出现胰岛素和胰高血糖素共定位细胞;EPA代谢产物引起已发生β细胞凋亡的小鼠胰岛中发生tdTomato荧光蛋白和胰岛素共定位;EPA代谢产物可促进胰岛αTC1细胞系细胞分泌胰岛素。结论 EPA及其代谢产物可通过促进胰岛α细胞转分化为β细胞,进而增加胰岛素的分泌,缓解T1DM小鼠的高血糖症状。

他达拉非肠溶缓释新剂型对输尿管梗阻引起的肾纤维化小鼠治疗作用的研究

目的:探讨他达拉非肠溶缓释新剂型对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)引起的肾脏纤维化模型小鼠的治疗作用。方法:C57BL/6J雄性小鼠(8周龄)随机分为假手术(sham)组、UUO模型组、他达拉非新剂型治疗(1 mg/kg)组和他达拉非原研药治疗(5 mg/kg)组,每组6只。采用手术构建UUO模型,造模后连续7 d灌胃治疗。应用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中肌酐(serum creatinine,SCr)水平,通过肾脏组织病理学染色和Western blot实验观察他达拉非肠溶缓释新剂型对肾脏纤维化小鼠的治疗作用。结果:与sham组相比,肾脏纤维化小鼠SCr水平显著升高,肾小管可见空泡变性、扩张,伴明显炎症细胞浸润和胶原纤维沉积,纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达显著增加(P<0.05);他达拉非新剂型和原研药治疗均可显著降低肾纤维化小鼠SCr水平,改善患侧肾组织结构的损伤,减少胶原纤维的沉积,抑制FN及α-SMA的表达和分布(P<0.05)。结论:他达拉非肠溶缓释新剂型可显著减少肾组织间质中细胞外基质的沉积,减轻输尿管梗阻引起的纤维化和肾功能损伤,且与他达拉非原研药相比,具有低剂量、高疗效的显著优势。

内源性ω-3多不饱和脂肪酸对顺铂诱导的骨髓抑制的保护作用

目的:利用mfat-1转基因小鼠,探讨内源性ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)对顺铂诱导的骨髓抑制的保护作用及减少骨髓有核细胞凋亡的作用机制。方法:将实验动物分为4组,分别为野生型小鼠正常对照组、mfat-1转基因小鼠正常对照组、野生型小鼠模型组、mfat-1转基因小鼠模型组。模型组小鼠在d 0和d 7腹腔注射顺铂7.5 mg/kg构建骨髓抑制模型,正常对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,每天观察小鼠状态并测量体重,14 d后取外周血进行血常规分析利用气相色谱检测外周血中PUFA的含量和比例;对各组小鼠股骨中骨髓有核细胞进行计数;通过组织病理学染色观察骨髓组织病理学变化;利用流式细胞术和荧光定量PCR技术检测各组小鼠骨髓组织中有核细胞凋亡情况和凋亡相关基因表达水平的变化。结果:与野生型小鼠相比,mfat-1转基因小鼠外周血中ω-3 PUFA含量显著增加且对顺铂具有更强的耐受性;外周血象分析结果显示,内源性ω-3 PUFA可促进骨髓抑制小鼠外周血中白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白的恢复;HE染色结果显示,内源性ω-3 PUFA显著改善顺铂诱导的骨髓组织结构损伤;流式细胞术和PCR结果显示,与野生型模型组小鼠相比,mfat-1转基因模型组小鼠骨髓有核细胞凋亡率显著降低(P<0.001),且抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达显著增加(P<0.01),而促凋亡基因Bax和Bak mRNA的表达显著降低(P<0.001,P<0.05)。结论:内源性ω-3 PUFA可通过调控凋亡相关基因的表达,减少顺铂引起的骨髓有核细胞凋亡,增加外周血细胞的数量,发挥对顺铂诱导的骨髓抑制的保护作用。

基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L.lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900 ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L.lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P_(32)和P_(8)为启动子、以及Tusp_(45)和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900 ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L.lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养缺陷型标记构建的L.lactis食品级表达载体的方法切实可行,可为推动L.lactis在食品和药用多肽生产中的应用提供研究基础。

慢性低氧大鼠TRPC1表达与肺动脉收缩变化时间曲线关系

目的探讨慢性低氧（chronichypoxia，CH）上调TR—PCI表达和SOCE介导肺动脉（pulmonaryarteris，PAs）收缩的时间曲线。方法清洁级6SD大鼠，常压低氧（氧分压为9．5％～10．5％）饲养，观察在不同时问点CH对TRPCI表达量和SOCE介导的PAs收缩的影响，描记其时问依赖性曲线。结果①CH上调平均右心室收缩压（mRVSP），低氧1d压力增高明显，7d达到最大值，21d后达到稳定；右心室质量指数（RVMI）低氧3d后开始增高，此后一直呈持续增高状态，直到21d达到稳定；②半定量RT—PCR检测显示，CH上调TRPCImRNA的表达量，低氧1d上调明显，3d达到最大值一直维持到7d，21d后达到稳定；③CH上调SOCE介导的PAs收缩，低氧3d开始上调，7d达到最大值，21d后达到稳定。结论CH早期TRPCI／SOCE明显上调，两者的时问曲线具有相关性，表明TRPCI和SOCE的上调在慢性低氧致肺高压的机制中发挥着重要作用。

三七皂苷R1对肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞SOCE的抑制作用

目的探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1)对慢性低氧(chronic hypoxia,CH)及野百合碱(monocrotaline,MCT)致肺高压(pulmonary hypertension,PH)大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)的作用。方法制备CH及MCT致PH大鼠模型,通过Mn2+淬灭Fura-2荧光和Fluo-3荧光检测胞质游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)观察三七皂苷R1对CH及MCT致PH大鼠PASMCs SOCE的作用。结果成功制备CH及MCT致PH大鼠模型;在硝苯地平预处理情况下,10μmol·L-1三七皂苷R1可明显降低环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱导CH及MCT致PH大鼠PASMCs Mn2+淬灭幅度、Mn2+最大淬灭率、胞膜Ca2+内流量和静息[Ca2+]i。结论三七皂苷R1对CH及MCT致PH大鼠PASMCs具有抑制SOCE和降低静息[Ca2+]i的作用。

三七皂苷R1对肺高压大鼠模型肺动脉的舒张作用

目的探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1)对慢性低氧(chronic hypoxia,CH)和野百合碱(monocrotaline,MCT)致肺高压(pulmonary hypertension,PH)大鼠模型肺动脉(pulmonary arteries,PAs)收缩效应的作用及其机制。方法清洁级♂SD大鼠随机分为3组。正常对照组;CH组:大鼠饲养于氧分压为10.0%±0.5%的密封有机玻璃箱内;MCT组:大鼠按60 mg·kg-1(BW)一次性腹腔注射20 mg·L-1的MCT。观察三七皂苷R1对两种肺高压模型大鼠PAs收缩效应的作用。结果可成功制备CH和MCT致肺高压大鼠;三七皂苷R1(0.1～100μmol·L-1)对10 nmol·L-1内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱发正常大鼠PAs收缩效应呈剂量依赖性舒张,EC50为(5.25±0.14)μmol·L-1;3 nmol·L-1Gd3+阻断ET-1诱发两种肺高压模型大鼠PAs收缩效应后,再加入三七皂苷R1无进一步抑制作用;6μmol·L-1三七皂苷R1对环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱发两种肺高压模型大鼠PAs收缩效应均有明显的抑制作用。结论三七皂苷R1可能通过阻断钙池操纵性钙内流介导的PAs收缩产生治疗肺高压作用。

ω-3多不饱和脂肪酸促进1型糖尿病模型小鼠胰岛β细胞再生的作用研究

目的探讨ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAs)促进胰岛α细胞向β细胞转分化的作用。方法在小鼠胰岛α细胞系αTC1培养基中添加不同配比的ω-3 PUFAs,4周后,利用荧光染色观察胰岛素和胰高血糖素的表达,并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测胰岛α细胞和胰岛β细胞特异性基因表达情况。野生型(WT)组和mfat-1转基因组小鼠连续5天腹腔注射60 mg·kg^(-1)链脲佐霉素(streptozocin,STZ)。选取注射STZ 7周后的WT小鼠,给予97%EPA和75%鱼油(50%EPA和25%DHA)饮食干预,每周检测随机血糖。8周后,通过免疫荧光染色观察小鼠胰腺中胰岛β细胞再生情况。结果在DHA与EPA混合液培养以及与单独EPA培养后,胰岛α细胞可分泌胰岛素,而对照组细胞没有胰岛素染色阳性;qRT-PCR结果显示,经过ω-3 PUFAs处理的细胞中,胰岛β细胞特异性基因明显上调。注射STZ后,mfat-1组和饮食干预组小鼠不仅随机血糖水平明显低于WT组,而且免疫荧光结果显示mfat-1组和饮食干预组小鼠胰岛中出现胰岛素和胰高血糖素共定位的细胞。结论初步证明ω-3 PUFAs能够促进胰岛α细胞分泌胰岛素,缓解1型糖尿病小鼠的高血糖症状。

TRPM8通道激活剂薄荷醇对肺动脉高压大鼠的治疗作用

目的 探讨瞬时受体电位M8(transient receptor potential melastatin-8,TRPM8)通道激活剂薄荷醇(menthol)对野百合碱(monocrotaline, MCT)诱导的肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)大鼠的治疗作用。方法 SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组:正常对照组、MCT组、MCT+menthol(1 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组、MCT+menthol(2 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组、MCT+menthol(5 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组、MCT+menthol(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组。腹腔注射MCT(50 mg·kg^(-1))构建PAH大鼠模型。造模1周后治疗组分别给予不同剂量的menthol灌胃治疗,持续2周。通过血流动力学检测、肺组织病理学染色、分子生物学技术,观察menthol对PAH大鼠右心室收缩压(RVSP)、右心室肥厚、肺小动脉(sPA)增殖重塑及钙通道蛋白(TRPM8、TRPC1、TRPC6)基因表达的影响。结果 与正常组相比,MCT组RVSP和右心质量指数(RVMI)明显升高,sPA(管腔直径50~150μm)管壁增厚,肺动脉中TRPM8表达明显降低,而TRPC1、TRPC6、心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)表达明显上调,表明PAH大鼠造模成功;不同剂量menthol治疗均可明显降低PAH大鼠的RVSP和RVMI,改善sPA增生情况,上调TRPM8的表达,同时明显降低TRPC1、TRPC6、ANP及BNP的表达。结论 Menthol通过抑制TRPC1、TRPC6、ANP和BNP的表达,明显减轻MCT诱导的PAH和右心室肥大。

新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对单侧输尿管梗阻引起的肾间质纤维化小鼠治疗作用

目的探讨新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteric obstruction,UUO)诱导的肾纤维化小鼠肾脏组织结构损伤及间质纤维化的影响。方法8周龄♂C57BL/6 J小鼠随机分为假手术组、模型组、CPD1治疗组,手术结扎模型组和治疗组小鼠左侧输尿管,假手术组仅分离输尿管而不结扎。造模2 h后,给予CPD1(5 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃治疗,持续7 d。通过组织病理学染色和Western blot,观察CPD1治疗对UUO小鼠患侧肾脏组织结构病变和纤维化标志蛋白:纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ)、肾损伤分子-1(kidney injury molecule 1,Kim-1)表达及分布的影响。结果与假手术组相比,UUO组小鼠患侧肾组织中肾小管扩张,可见明显空泡变性,炎症浸润增加,FN、α-SMA、collagen-I及Kim-1蛋白的表达明显增加(P<0.05);CPD1可明显改善UUO模型小鼠患侧肾脏的结构,降低胶原纤维蛋白的沉积,纤维化标志蛋白FN、α-SMA、collagen-I及Kim-1的表达均得到明显抑制(P<0.05)。结论磷酸二酯酶5抑制剂CPD1通过下调细胞外基质ECM的沉积,减少Kim-1介导的肾损伤,改善输尿管梗阻诱导的肾间质纤维化,其具体的作用机制还有待进一步研究。

重组人α-半乳糖苷酶在悬浮CHO-S细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定

目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide, Gb3 or GL3)的清除效果。方法 构建人α-半乳糖苷酶基因gla融合6×His标签的表达载体pcDNA4-GLA,将其转染至悬浮CHO-S细胞中,表达纯化并检测rhα-Gal A糖基化形式、表达量及酶活性;通过与人皮肤成纤维细胞共孵育,观察rhα-Gal A是否能被摄取到胞内并有效清除Gb3。结果 研究结果显示,rhα-Gal A成功在CHO-S细胞中表达,表达量最高可达(100±20.6) mg·L^(-1),且rhα-Gal A被糖基化修饰,酶活与商品酶Fabrazyme酶活相近,为(59±9.1) kU·g^(-1);此外,rhα-Gal A能被有效摄取到人成纤维细胞胞内并靶向溶酶体进而有效清除Gb3。结论 利用瞬时转染技术在悬浮CHO-S细胞中成功表达并纯化出rhα-Gal A,具有良好的生物学活性且可有效清除Gb3,为我国法布雷病的酶替代疗法提供新的选择。

新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠治疗作用

目的探讨新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl 4)诱导的肝纤维化小鼠肝组织结构损伤和肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化的影响。方法SPF级雄性C57BL/6 J小鼠随机分为正常对照组、模型组、CPD1治疗组、他达拉非治疗组,模型组和治疗组小鼠腹腔注射CCl 4(每周2次)。造模4周后治疗组分别给予CPD1(2 mg·kg^(-1)·d^(-1))、他达拉非(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃治疗,持续4周。模型到期后,通过组织病理学染色、免疫荧光技术观察CPD1治疗对肝纤维化小鼠肝形态、组织结构损伤、胶原沉积及HSCs活化标志物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、人肝星状细胞系LX-2细胞中纤维连接蛋白(fibronectin)表达和分布的影响。结果与正常组相比,模型组小鼠肝组织出现肝细胞坏死,炎症细胞浸润增加,肝小叶结构破坏,汇管区出现胶原沉积,α-SMA表达和分布明显增加;CPD1治疗可明显减轻模型小鼠肝组织损伤程度,减少肝细胞坏死和炎症细胞浸润,减轻胶原纤维的沉积,降低α-SMA的表达及分布,且治疗效果优于他达拉非;同时CPD1明显抑制LX-2细胞中转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的fibronectin和PAI-1蛋白的表达。结论磷酸二酯酶5抑制剂CPD1通过抑制HSCs的激活,减少肝组织中胶原纤维蛋白的产生,延缓肝纤维化的进展。

脱细胞真皮基质水凝胶的制备及生物学评价

背景:最近脱细胞真皮基质水凝胶因其可注射性和能填充不规则空间,在组织填充与修复中有着广阔的应用前景,而细胞相容性和生物相容性是组织修复的关键,探究脱细胞真皮基质水凝胶的相容性具有重要意义。目的:构建一种脱细胞真皮基质水凝胶,用于组织填充和修复。方法:制备可注射型脱细胞真皮基质水凝胶,扫描电镜下观察其微观形貌。将质量浓度8,10 g/L的脱细胞真皮基质水凝胶分别与骨髓间充质干细胞共培养,检测细胞增殖与细胞相容性。将蛋白质量浓度0.25,0.5 g/L的脱细胞真皮基质水凝胶分别注射至同一SD大鼠背部皮下不同部位,术后2,4周,观察水凝胶降解情况。将蛋白质量浓度1,1.5,2 g/L的脱细胞真皮基质水凝胶分别注射至同一SD大鼠背部皮下不同部位,术后8,16周,观察水凝胶降解情况,并进行组织学分析。结果与结论:①扫描电镜下可见,脱细胞真皮基质水凝胶呈现一种不规则随机走向的多孔纤维结构,孔径大小不一。②共培养1,3,5 d后,两种浓度的水凝胶对骨髓间充质干细胞的增殖无影响;共培养1,2,3 d后的Live/Dead染色显示,两种浓度的水凝胶对骨髓间充质干细胞的增殖无影响,但水凝胶上的细胞形态发生了一定变化。③蛋白质量浓度0.25 g/L的水凝胶皮下注射2周后降解,0.5 g/L的水凝胶皮下注射4周后降解,1,1.5,2 g/L的水凝胶皮下注射16周均未降解,甚至可能保留更长时间。苏木精-伊红染色显示,皮下注射8周后,3种蛋白质量浓度水凝胶组织较为致密,出现少量的炎症浸润,2 g/L组有微血管生成;16周后,水凝胶组织变得松散,以1 g/L组较明显,炎症浸润减轻。免疫组化染色显示,随着注射时间的延长,水凝胶中的微血管数量增加;并且随着蛋白质量浓度的增加,水凝胶中的微血管数量增加。④结果表明,可注射脱细胞真皮基质水凝胶具有良好的细胞相容性和生物相容性。

FKBP38蛋白对子宫内膜癌前期病变的影响及其机制研究

目的构建子宫特异敲除FKBP38小鼠模型,探究FKBP38对于小鼠子宫内膜癌前期病变的影响及其作用机制。方法通过胚胎注射法使小鼠FKBP38基因上携带loxP位点,构建转基因小鼠模型。在此基础上,以在子宫特异表达的孕酮受体启动子Pgr-Cre小鼠介导FKBP38条件性敲除,以获得FKBP38子宫特异敲除小鼠模型Pgr-Cre;FKBP38^(fl/fl)。通过PCR及Western blot对子宫特异敲除FKBP38小鼠进行鉴定;通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)检测小鼠子宫敲除FKBP38后组织病理性变化;通过Western blot技术检测小鼠子宫敲除FKBP38后对mTOR通路的影响。结果小鼠子宫特异敲除FKBP38后子宫中FKBP38蛋白表达水平明显降低,与同年龄同窝小鼠相比,差异有统计学意义(P<0.01)。在己烯雌酚刺激下,小鼠18月龄时,子宫特异敲除FKBP38小鼠中16.7%(1/6)发生复杂性非典型性增生(complex atypical hyperplasia,CAH),33.3%(2/6)发生简单性增生(simple hyperplasia,SH)。此外,子宫特异敲除FKBP38小鼠子宫中AKT、S6及4E-BP-1蛋白的磷酸化水平明显升高。结论子宫特异敲除FKBP38小鼠子宫中FKBP38蛋白明显降低,表明小鼠子宫特异敲除模型构建成功。此外,子宫特异敲除FKBP38后,小鼠发生SH以及CAH,表明FKBP38可能与子宫内膜癌癌前病变相关。这可能与FKBP38调控mTOR通路关键性蛋白Akt、S6及4E-BP-1蛋白的磷酸化相关。

新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对百草枯诱导的肺纤维化大鼠治疗作用

目的探讨新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对百草枯(paraquat,PQ)诱导的肺纤维化大鼠肺组织病理结构损伤和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法模型组和治疗组大鼠腹腔注射PQ(30 mg·kg^(-1)),2 h后分别灌胃CPD1(5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、尼达尼布(50 mg·kg^(-1)·d^(-1)),持续4周。观察CPD1治疗对肺纤维化大鼠肺组织病理结构损伤、胶原沉积及EMT标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的影响。结果模型组大鼠肺组织指数明显增大,肺泡塌陷和扩张弥漫性分布,肺泡壁及肺泡间隔均增厚,肺间质胶原沉积增多,E-cadherin表达降低,而α-SMA和纤维连接蛋白表达增加(P<0.01);CPD1治疗可明显减轻模型大鼠肺组织病理结构损伤程度,减少肺泡塌陷和扩张,减轻胶原纤维的沉积,上调E-cadherin表达,降低α-SMA和fibronectin的表达(P<0.01)。结论CPD1可能通过抑制EMT和炎症,减少肺组织间质胶原纤维的产生,减缓PQ引起的肺纤维化进展。

CRP敲除通过介导Kupffer细胞分化对大鼠血清总胆固醇水平的影响

目的:研究C-反应蛋白(CRP)基因全身敲除介导肝巨噬细胞[库普弗(Kupffer)细胞]分化以及对大鼠血清总胆固醇水平的影响。方法:利用TALEN技术构建CRP基因敲除大鼠模型,PCR技术鉴定其基因型,筛选纯合子后代(纯合敲除为CRP^(-/-),野生型为CRP+/+),随机选择10只SPF级雄性CRP^(-/-)大鼠(8周龄)为模型组,10只SPF级雄性CRP+/+大鼠(8周龄)为正常对照组。用Western blot、RT-qPCR和免疫组织化学技术验证CRP在CRP^(-/-)大鼠重要脏器中的表达情况;胆固醇试剂盒检测大鼠血清总胆固醇水平;RT-qPCR检测CRP^(-/-)大鼠肝脏M1型巨噬细胞中CCL2、CCL3和IL-6表达水平,以及M2型巨噬细胞中IL-4、IL-10和转化生长因子β(TGF-β)表达水平;用分子生物学技术检测CRP^(-/-)大鼠肝脏中M1型巨噬细胞标志物CD68、M2型巨噬细胞标志物CD163及胆固醇逆向转运(RCT)关键蛋白B族1型清道夫受体(SR-B1)的表达水平。结果:与CRP+/+大鼠相比,CRP^(-/-)大鼠心、肝、肾、脾等重要脏器未检测到CRP表达(P<0.01),表明CRP^(-/-)大鼠模型构建成功。CRP^(-/-)大鼠血清总胆固醇显著低于CRP+/+大鼠(P<0.01),肝脏中IL-6、CCL2和CCL3水平显著降低,而IL-4、IL-10和TGF-β表达显著增高(P<0.01);M1型巨噬细胞标志物CD68表达水平显著下降,而M2型巨噬细胞标志物CD163表达水平显著上升(P<0.01);CRP^(-/-)大鼠肝脏内SR-B1水平显著高于CRP+/+大鼠(P<0.05)。结论:CRP基因全身敲除影响Kupffer细胞分化并降低大鼠血清总胆固醇水平,具体表现为:促进大鼠肝脏内单核细胞分化为M2型巨噬细胞,并抑制其向M1型巨噬细胞分化,显著促进大鼠肝脏内RCT从而降低大鼠血清总胆固醇。

钾通道阻滞剂四乙基铵敏感性钾电流在肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞中的变化

目的研究大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中电压依赖性钾通道(voltagedepending potassium channel,K_V)电流在肺高压(pulmonary hypertension,PH)中的变化,及钾通道阻滞剂四乙基铵(tetraethylammonium,TEA)对K_V电流的影响。方法采用全细胞膜片钳技术记录PASMCs的K_V电流,观察PH大鼠中K_V电流的变化,以及TEA对K_V的影响。结果野百合碱(monocrotaline,MCT)、慢性低氧(chronic hypoxia,CH)明显减小了大鼠PASMCs上记录到的K_V电流密度;TEA干预能够明显降低正常和PH大鼠PASMCs的K_V电流,并且TEA对K_V电流的抑制作用在PH大鼠中明显减小。结论在CH、MCT诱导的两种PH大鼠模型中,PASMCs的K_V开放程度被明显抑制,而且其对应的TEA敏感性K_V电流明显减小。

新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对肺动脉高压大鼠血管收缩的影响

目的探讨新型磷酸二酯酶5抑制剂CPD1对肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)大鼠肺动脉和主动脉收缩效应的影响。方法一次性腹腔注射野百合碱(monocrotaline,MCT,50 mg·kg^(-1)),制备PAH大鼠模型,造模7 d后给予CPD1(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃治疗,持续14 d。通过血管环张力检测技术观察CPD1对MCT致PAH大鼠血管收缩效应的作用。结果成功制备PAH大鼠模型;CPD1治疗可显著降低PAH大鼠右心室收缩压和右心质量指数,改善肺小动脉内膜增生情况,抑制苯肾上腺素(phenylephrine,Phen)和内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱导的PAH大鼠肺动脉和主动脉的收缩效应,而对KCl诱导的血管收缩效应无影响。结论磷酸二酯酶5抑制剂CPD1干预能抑制PAH大鼠模型,其机制可能是CPD1抑制PAH大鼠非电压依赖性钙通道功能,引起血管收缩力降低、血管平滑肌增殖减弱和血管重塑减轻。

FKBP38蛋白对人源子宫内膜癌细胞增殖及侵袭的调控

目的探讨FK506结合蛋白38(FK506-bindingprotein 38,FKBP38)在不同分级子宫内膜癌细胞中表达水平,研究其对细胞增殖、侵袭力影响及相关机制。方法选取5种不同病理分级人源子宫内膜癌细胞,实时荧光定量PCR及Western blot技术检测FKBP38表达。将FKBP38过表达病毒转入细胞,实时荧光定量PCR及Western blot验证过表达情况;Edu染色法、平板克隆法检测细胞增殖能力;Transwell小室检测细胞迁移及侵袭能力。Western blot检测过表达FKBP38后mTOR通路变化。结果FKBP38蛋白在病理分级较高(2~3)级的子宫内膜癌细胞中表达明显降低(P<0.01)。AN3Ca细胞系中过表达FKBP38后,细胞增殖活性、迁移及侵袭的能力均明显降低(P<0.01),此外,细胞Akt蛋白磷酸化水平降低。结论FKBP38表达水平与子宫内膜癌的进展显著相关,AN3Ca细胞中过表达FKBP38可显著降低细胞增殖、迁移及侵袭能力,这可能与其下调Akt蛋白磷酸化水平有关。FKBP38在子宫内膜癌中的表达量有望成为治疗子宫内膜癌的全新手段。