催乳素诱导蛋白基因表达与不同乳腺癌分子分型患者预后的关系

目的:探讨催乳素诱导蛋白(PIP)基因表达与不同乳腺癌分子分型预后的关系。方法:检索基因表达综合数据库(GEO)中乳腺癌转录组水平基因表达数据集临床信息,根据基因表达水平进行乳腺癌分子分型,采用Cox比例风险回归分析生存率,Kaplan-Meier分析PIP基因表达与患者预后的关系。结果:从GEO获取有效的乳腺癌数据集48个,共纳入7926例乳腺癌患者。其中Basal-like型、Lunimal A型、Luminal B型和HER2+型分别占19.44%,46.74%,26.63%和7.18%。在不区分治疗方式和只分为未经系统性治疗组及系统性治疗组中,无论是无远处转移生存期(DMFS)、无复发生存期(RFS)、进展后生存期(PPS)和总生存期(OS),PIP基因高表达组较低表组患者生存期显著性延长(P<0.05)。在仅内分泌治疗组和仅化学药学治疗组中,与PIP基因低表达组患者比较,PIP基因高表达组患者RFS和DMFS生存时间显著性延长(P<0.05),PPS和OS生存时间无显著性差异(P>0.05)。在乳腺癌分子分型中,PIP基因高表达组与PIP基因低表达组比,仅Luminal A型组中RFS和DMFS生存时间显著性延长(P<0.05)。结论:PIP基因高表达与Lunimal A型乳腺癌患者预后密切相关,PIP基因表达联合乳腺癌分子分型能更好地评价乳腺癌患者预后。

鼻咽癌患者血清中自身抗体的初步检测

目的:探讨鼻咽癌患者血清中是否存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体,为寻找鼻咽癌新的肿瘤标志物提供依据。方法:制备Epstein-Barr病毒阴性的鼻咽癌细胞株CNE1细胞板,酶联免疫吸附实验(ELISA)分析其与32例鼻咽癌患者血清和54例正常血清反应的差异性;提取CNE1总蛋白,Western印迹分析其与鼻咽癌患者血清反应是否存在特异性的蛋白质。结果:ELISA分析显示鼻咽癌患者血清平均滴度(0.904±0.032)明显高于正常人血清平均滴度(0.736±0.028)(P<0.01);Western印迹分析发现鼻咽癌患者血清与正常人血清相比,部分阳性条带一致,但条带强度增加,还发现出现了部分新的阳性条带,这些条带可能属于鼻咽癌相关抗原或鼻咽癌特异性抗原。结论:鼻咽癌患者血清中存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体,这些抗体并非针对Epstein-Barr病毒,为寻找鼻咽癌血清肿瘤标志物提供了依据。

荧光定量PCR检测在宫颈癌筛查中的应用

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测宫颈病变人乳头瘤病毒（HPV）13种高危型DNA的可行性，为检测宫颈组织中HPV的感染提供有效的方法。方法选择197例阴道细胞学检测异常的宫颈脱落细胞，使用FQPCR方法检测13种高危犁HPV DNA，同时取宫颈病变处组织进行组织病理学检查。结果329例样本中HPV 13种高危型阳性者218例，阳性率为66．26％：CT值范围在13～40之间，平均为（26±2．31）；组织病理学检测186例阳性，阳性率为56．53％，经x^2检验，差异有统计学意义（x^2=6．566，P=0．0104）；阴性标本为Undet。结论FQ-PCR方法检测宫颈病变中13种高危型HPV DNA感染，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，对宫颈癌的普查和治疗有指导意义。

基于3'/5'端表达不平衡策略的荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌患者血浆游离循环RNA中ALK融合基因

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆游离循环RNA(cfRNA)中的ALK融合基因的表达水平,为指导临床个体化用药提供依据。方法选取经高通量测序验证的已知ALK融合基因的NSCLC患者13例、ALK融合基因阴性的NSCLC患者16例和30例体检健康者,采集各组血液样本并分离血浆cfRNA,用荧光定量PCR检测各组ALK基因3'端第20外显子(E20)和5'端3外显子(E3)的表达量,并计算ALK融合基因的表达水平。结果已知ALK融合基因的NSCLC患者、ALK融合基因阴性的NSCLC患者和体检健康者血浆cfRNA中ALK融合基因表达水平分别为278.3(45.3,987.4),4.08(0.38,9.04),3.77(0.34,8.37),各组间差异有统计学意义(H=29.93,P<0.01);组间两两比较结果表明,已知ALK融合基因的NSCLC患者血浆中ALK融合基因的表达水平高于ALK融合基因阴性的NSCLC患者或体检健康者(U分别为0,0,P均<0.01),而后两组间差异无统计学意义(U=232,P=0.86)。结论基于3'/5'端表达不平衡策略的荧光定量PCR法可以快速检测NSCLC患者血浆cfRNA中ALK融合基因。

LNA PCR检测骨髓增殖性疾病JAK2基因V617F突变

目的:建立一种检测酪氨酸激酶2(JAK2)基因V617F突变的锁核酸PCR(LNA PCR)方法,并探讨其对骨髓增殖性疾病(MPD)的临床应用价值。方法:收集68例确诊为MPD患者外周血或骨髓标本,其中真性红细胞增多症(PV)37例、原发性血小板增多症(ET)22例、原发性骨髓纤维化(MF)9例。根据JAK2基因V617F突变位点设计引物和LNA,建立快速检测JAK2基因V617F突变的LNA PCR方法,同时以DNA直接测序法进行验证,并检测上述标本JAK2基因V617F突变率。结果:所建立的LNA PCR方法能有效检测JAK2基因V617F突变,其特异性和灵敏度明显高于DNA测序法(P<0.05);LNA PCR方法可以检测出1%的JAK2基因V617F突变型杂合子。68例MPD患者标本共检测出JAK2基因V617F突变55例,检出率80.88%。其中37例PV中JAK2基因V617F突变34例(91.89%),22例ET中JAK2基因V617F突变15例(68.18%),9例MF中JAK2基因V617F突变6例(66.67%)。结论:LNA PCR方法检测灵敏度高,能有效提高JAK2基因V617F突变检出率。

鼻咽癌相关抗原基因NPC-A-6的生物信息学分析

【目的】应用生物信息学的方法分析鼻咽癌相关抗原基因NPC A 6的组织分布情况 ,以推测鼻咽癌相关抗原基因NPC A 6的生物学功能与特性。【方法】应用美国国家生物信息中心 (NCBI)中的核酸数据库、EST数据库、Unigen数据库和相应软件分析。【结果】鼻咽癌相关抗原基因NPC A 6定位于 9p2 4 .3,由三个外显子和两个内含子组成 ,广泛表达于许多正常组织如前列腺、脂肪、耳等 ,但在胃癌、子宫瘤、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌等肿瘤组织中表达明显上调 ,而在相应正常组织中不表达或低表达。【结论】鼻咽癌相关抗原基因NPC A 6编码的抗原可能与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。

中国人群HCV精确基因分型和新亚型的鉴定

本刊编委，武汉大学人民医院检验医学中心童永清等于2015年在《Clinical Microbiology and Infeetion》（2区，IF=5．768）发表了题为“Accurate genotyping of hepatitis C virus through nucleotide sequencing and identification of new HCV subtypes in China population”的研究论文，主要内容如下：

32例肝母细胞瘤诊断与治疗的临床分析

目的探讨肝母细胞瘤的诊断与治疗,分析影响肝母细胞瘤诊断与治疗效果的因素。方法对本院2001年1月～2009年1月收治的32例经手术病理确诊的肝母细胞瘤患者的临床资料进行分析。结果32例手术全部成功,其中行右半肝切除术8例,右肝肿瘤局部切除术12例,左外叶切除术1例,左半肝切除术5例,中肝叶切除6例。结论肝母细胞癌最基本的治疗方法是手术切除,应提高对肝母细胞瘤的认识,及早发现,及时治疗,术后定期观察,综合治疗是提高生存率的关键。

脂蛋白、载脂蛋白与超敏C反应蛋白联合检测在冠心病诊断中的意义

目的探讨冠心病(CHD)患者血清中脂蛋白Lp(a)、载脂蛋白(ApoA1、ApoB、ApoE)及超敏C反应蛋白(hs-CRP)的表达水平与冠心病严重程度的相关性。方法在该院随机选取137例健康者及148例冠心病患者,并对血清脂蛋白Lp(a)、载脂蛋白(ApoA1、ApoB、ApoE)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)进行统计学分析。结果与健康组相比,冠心病患者血清中脂蛋白Lp(a)、载脂蛋白ApoE、超敏C反应蛋白(hs-CRP)均有不同程度的升高(P<0.05),而年龄、性别,ApoA1、ApoB、ApoA1/ApoB水平均差异无统计学意义(P>0.05)。结论血清中Lp(a)、ApoE、hs-CRP是CHD发病的重要危险因素,与CHD的发生、发展及预后密切相关,联合检测对冠心病具有较高的临床诊断价值。

湖北地区非小细胞肺癌EGFR基因突变及其意义的研究

目的探讨湖北地区非小细胞肺癌（NSCLC）患者中 EGFR基因的突变情况，评价湖北地区 EGFR突变的检测力度，为临床合理选择酪氨酸激酶抑制剂提供可靠的实验依据。方法采用 PCR-sanger测序法以及 ADx-ARMS法检测2010～2015年期间253例肺癌标本中 EGFR基因突变情况，探讨不同检测手段的敏感度，探讨不同性别、不同组织分型间EGFR不同外显子的突变频率差异及其临床意义。结果253例肺癌标本中共检测到突变位点93个，以 E19和 E21的突变最为常见，占比为53.76％和35.38％。ADx-ARMS法的 EGFR总突变检出率明显高于 Sanger测序法（P＝0.001）。女性肺癌患者的检出率明显高于男性（P＝0.001）。不同组织分型中，腺癌（38.01％）的检出率最高，腺鳞癌（30.77％）与大细胞癌（20％）次之，鳞癌（4.55％）较低。无吸烟史的肺癌患者检出率（51.6％，81／157）明显高于有吸烟史患者（24％，12／50）。结论与PCR-sanger测序法相比，ADx-ARMS法对临床筛选 EGFR-TKI治疗的受益亚群，预测 EGFR-TKI疗效更为敏感有意义。湖北地区女性肺癌患者中 EGFR突变频率明显高于男性，与激素水平变化及吸烟状况有关。

无精症及严重少精症Y染色体微缺失和生殖激素水平研究

目的探讨少精症及严重无精症患者与Y染色体AZF基因微缺失的关系。方法采用多重PCR方法对染色体核型正常的346例严重少精症和无精症患者进行Y染色体AZF基因微缺失检测，同时用化学发光法测定生殖激素水平。结果346例患者中发现Y染色体微缺失患者17例，缺失率为4．9％，其中262例重度少精症中Y染色体微缺失14例（5．3％），84例无精症患者中Y染色体微缺失3例（3．6％）。微缺失类型包括单纯AZFa微缺失2例；单纯AZFb微缺失3例；单纯AZFc微缺失11例；AZFb＋AZFc微缺失1例。30例精液正常者Y染色体均未发现AZF基因微缺失。生殖激素检测结果显示，Y染色体微缺失患者血清FSH，LH和T水平分别为18．76±9．62IU／L，6．05±4．48IU／L和378．54±158．98mmol／L。与无微缺失患者相比，Y染色体微缺失患者血清FSH水平显著性升高（t=3．930，P=0．006）、T水平显著性降低（t=-2．602，P=0．011）。结论Y染色体微缺失及血清生殖激素水平异常与少精症、无精症密切相关，其中AZFc缺失为常见的类型。

武汉地区丙型肝炎病毒基因分型与慢性丙型肝炎患者肝功能和血液指标分析

目的了解武汉地区慢性丙型肝炎患者基因型分布特点,分析HCV不同基因型患者肝功能及血液学指标的变化。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对临床已诊断为丙肝患者(病例组)进行HCVRNA载量检测,并使用PCR直接测序法进行HCV基因分型,同时检测每位患者肝功能和血液学指标。另选90例健康体检者(对照组)进行相同检测。结果 90例慢性丙肝患者中以HCV1b型和2a型为主,分别为74例(82%,RNA载量对数值为8.19±2.33)和7例(7.2%,RNA载量对数值为6.12±1.56)。患者肝功能指标高于对照组,血液学指标低于对照组(P<0.05或P<0.01),但不同基因型患者肝功能和血液学指标测值未见明显差异(P>0.05)。结论武汉地区HCV基因分型及慢性丙肝患者肝功能、血液学检查对临床治疗有重要意义。

基因芯片技术在成人下呼吸道感染病原学检测中的临床应用及评价

目的调查了解成人下呼吸道感染的病原谱,评价基因芯片检测技术在成人下呼吸道感染病学检测中的临床应用价值。方法留取因下呼吸道感染住院的成人患者下呼吸道标本,分别进行常规培养及29种病原体基因芯片法检测,并对检测结果进行统计分析。结果共入组451例患者,A组(18~45岁)63例,B组(45~60岁)95例,C组(>60岁)293例;基因芯片法病毒的总检出率为77.61%,C组较高,但差异无统计学意义(χ~2=4.97,P>0.05)。基因芯片法细菌的总检出率为59.20%,阳性菌以肺炎链球菌为主,A组患者检出率较高,但差异无统计学意义(χ~2=1.38,P>0.05);阴性菌以流感嗜血杆菌及鲍曼不动杆菌为主,流感嗜血杆菌在B组患者检出率较高,但差异无统计学意义(χ~2=5.73,P>0.05),非发酵菌在C组患者检出率较高,但差异无统计学意义(χ~2=4.72,P>0.05),肠杆菌科细菌在C组患者检出率较高,差异有统计学意义(χ~2=9.83,P<0.05)。基因芯片法白色念珠菌的总检出率为28.60%, C组较高,差异有统计学意义(χ~2=7.06,P<0.05)。基因芯片检测与流感病毒感染临床诊断对比,总符合率为80.93%,敏感度18.75%,特异度94.34%,阳性预测值41.67%,阴性预测值84.34%;与传统细菌培养结果对比,总符合率为83.59%,敏感度50.45%,特异度94.41%,阳性预测值74.67%。结论病毒检出率较高,阳性菌以肺炎链球菌为主,阴性菌以流感嗜血杆菌及鲍曼不动杆菌为主,不典型病原体较少见;病毒、阴性菌及真菌在>60岁患者检出率较高;与传统培养法及流感临床拟诊相比,基因芯片检测技术有较高的符合率、特异度及阴性预测值。

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的:构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库,从中筛选抗肝癌单链抗体(scFv),并对其特异性进行鉴定。方法:采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库。对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选,获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果:scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库。对抗体库进行3轮正负淘选和富集后,随机挑取2798个克隆进行ELISA,发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应,而与QSG-7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应。对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定,结果与ELISA一致。免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义。结论:构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库。通过淘选富集、ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆,为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础。

乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法，并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物，并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件；将T载体与HBVRT区扩增后纯化的产物进行连接反应，然后转染大肠杆菌（DH5a），经蓝、白斑筛选后挑取阳性菌落，提取质粒，制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：10的缓冲液倍比稀释，制作标准曲线，线性方程为：Y=-3．344X＋37（r2=0．9999）；通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA，表明其最低检测限为5×10^2 IU／mL；拷贝数介于5×10^2～5×10^8 IU／mI。之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法；该方法可用于乙型肝炎患者病情监测，有效指导临床用药；联合该法与血清标志物检测，可更准确评价HBV感染者病情。

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体,对其产物做初步鉴定,为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术,PCR扩增G22ScFv基因,并将其克隆到原核表达载体pET25b(+)上,将重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,表达的蛋白经His-tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS-PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b(+)-G22经测序检测,序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD,同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95%以上。结论利用基因重组技术,在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化,为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。

中国人群脂联素基因启动子区-11377C/G位点多态性与2型糖尿病易感性的Meta分析

目的探讨中国人群脂联素基因启动子区-11377C/G位点多态性与2型糖尿病易感的相关性。方法检索2011年11月前中国生物医学文献数据库(CBM)、中国期刊全文数据库(CNKI)、万方数据库、维普中文科技期刊数据库(VIP)及Med-line、Cochrane Library、Embase、Springer、Ovid等数据库,收集有关中国人群脂联素基因-11377C/G多态性与2型糖尿病的相关性研究;评价纳入研究质量,提取有效数据,采用ReviewManager5.0软件进行Meta分析。结果共纳入12组研究中国人群脂联素基因启动子区-11377C/G位点多态性与2型糖尿病的相关性的病例-对照研究,2型糖尿病病例2598例,对照4508例。Meta分析发现,脂联素基因启动子区-11377C/G位点C/G多态性与2型糖尿病相关性中G等位基因与C等位基因[OR=1.14,95%CI(1.03,1.25),P=0.009]、基因型(CG+GG)与CC[OR=1.19,95%CI(1.06,1.35),P=0.004]、基因型CG与CC[OR=1.14,95%CI(1.00,1.29),P=0.05]、基因型GG与CC[OR=1.34,95%CI(1.06,1.71),P=0.02]均具有统计学意义差异。结论中国人群脂联素基因启动子区-11377C/G位点多态性与2型糖尿病易感性存在相关性。

肿瘤基因EGFR检测方法的研究进展

表皮生长因子受体（EGFR）是一种受体酪氨酸激酶,其基因位于7p12～14区,含28个外显子,相对分子质量为170×103,是一种跨膜糖蛋白,由1186个氨基酸残基组成,广泛存在于人体中。在结构上分为3个区：细胞外配体结合区、跨膜区和细胞内酪氨酸激酶活性区。其中酪氨酸激酶活性区由18～24外显子编码,有542个氨基酸,并且有典型的ATP结合位点与酪氨酸激酶区,

湖北地区慢性丙型肝炎患者HCV RNA基因测序分型及疗效评估

目的 应用基因测序技术检测分析湖北地区慢性丙型肝炎患者的基因型特点,探讨基因型、HCV病毒载量的治疗基线与聚乙二醇干扰素、利巴韦林抗病毒治疗效果的关系.方法 对168例慢性丙型肝炎患者,用基因测序仪测定靶片段的基因序列,分析患者HCV基因型及分布特点;选取进行抗病毒治疗的患者,检测治疗前后不同时间点HCV-RNA含量、HCV基因型,评估治疗效果.结果 本研究中检测的慢性丙型肝炎患者HCV基因型有1b型,2a型,6b型,1b/2a混合型,1b/2k混合型,6d/6k混合型.其中,HCV 1b型149例（89%）,2a型8例（5%）,1b/2a型5例（3%）,6b型3例（2%）,1b/2k型2例（1%）,6d/6k型1例（0.7%）.1b型患者显著多于其他型别患者（χ2=754.3,P〈0.01）.选取进行疗效评估的患者,非1b型患者的快速病毒应答（RVR）的比例显著高于1b型患者（χ2=4.67,P〈0.05）.不同基线HCV RNA水平与患者的病毒学应答无显著性差异（χ2=0.17,0.22,1.51,0.09,均P〉0.05）.结论 湖北地区HCV RNA基因型以1b型为主,亦可见混合型及罕见型别.非1b型患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林抗病毒治疗能获得更好的治疗效果.

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体fuse5连接后,电击转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库.用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选.筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序.结果表明,经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCR,扩增出6种VH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因,经连接组成54种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗体库,全长ScFv基因的插入率为80%.用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后,从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选,得到179个阳性克隆,阳性率为33.6%.将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定,发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应,免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应,而不与正常肝组织反应.且A82的相对亲和力为2.4mol/L,解离常数Kd为5.32×10-9mol/L,显示其亲和力较高.对克隆A82进行测序分析,结果表明:A82全长742bp,含linkercDNA序列45bp,重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3%的同源性,轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94.9%的同源性,V-D-J分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2.由上述结果可见,应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术,构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌单链抗体库,通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定,获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性,为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.