不同中医治法对ras/MAPK信号通路相关基因转录调节的实验研究

目的 :研究中医治疗原发性肝癌的清热解毒、活血化瘀、健脾理气等常用不同方法对实验性肝癌的作用机理。方法 :以二乙基亚硝胺水溶液诱发大鼠肝癌形成 ,采用RT PCR方法分别观察这些不同中医治法对癌基因ras MAPK信号传导通路上相关基因转录的调节作用。结果 :这些不同治法能够针对性地调节癌基因ras MAPK信号通路上一些信号分子的转录水平 ,其中清热解毒法对raf1基因、活血化瘀法对Grb 2和raf 1基因、健脾理气法对sos基因的转录水平有显著的下调作用 ,各治法均能上调GAP基因的转录水平。结论 :不同中医治法能够不同程度地调节肝癌发生发展过程中一些促使细胞过度增殖的信号分子的转录 ,并且这些治法有不同的选择性。

中药五味标准化检验方法的建立

目的:探索和建立标准化中药五味检验方法。方法:试验人员经培训后,10人同步、盲法对黄柏等10味中药饮片和黄连解毒汤等6张小复方标准水煎剂以及小檗碱等7个中药有效组分溶液进行品味和打分及综合评价,并研究和建立标准化中药五味检验的方法。结果:(1)知母、黄柏、生栀子、生大黄、苦参、生黄芪、生晒参、淫羊藿、制附子、制吴茱萸等10味中药饮片五味检验结果多与2005《中华人民共和国药典》所载近似,但有较为准确的程度刻画与区分;个别药物如淫羊藿、制附子以苦味为主,而非《药典》所载的辛、甘;(2)首次对黄连解毒汤、大黄附子汤、左金丸、参附汤、吴茱萸汤、疗本滋肾丸等6个小复方的五味进行了检验与刻画;(3)首次对菝葜皂苷元、小檗碱、栀子苷、大黄酚、大黄素、淫羊藿苷、乌头碱等7个中药有效组分进行了检验与刻画,发现这些组分多与其对应饮片的五味近似,惟大黄素、大黄酚未能检出生大黄的苦味,而菝葜皂苷元的苦味也远弱于知母。结论:所建立的中药五味的标准化检验方法能准确、客观、量化地检出中药、中药小复方和中药有效组分的五味,这对于验证已有中药五味及当代中药新药标准化研发是有益的。

健脾理气法下调大鼠肝癌信号转导有关基因转录水平的筛选

目的:筛选出健脾理气法明显下调大鼠肝癌组织中与信号转导有关的基因。方法:以DEN诱导大鼠肝癌形成为模型,以西药喃氟啶化疗、中医清热解毒、活血化瘀治法为对照治疗,采用基因芯片技术,观察健脾理气法对大鼠肝癌组织基因组转录水平及信号转导相关基因转录的调控作用。结果:①与模型组比较,各中医治法下调最明显的基因分别为:清热解毒法明显下调140个基因,活血化瘀法明显下调186个基因,健脾理气法明显下调689个基因;②在健脾理气法明显下调的163个已知基因中,筛选出19个与信号转导相关的基因。讨论:基因芯片很好地揭示了不同中医治法各自防治肝癌的分子作用靶点,其中,健脾理气法下调大鼠肝癌组织与信号转导有关的基因转录中,涉及到细胞信号转导网络的多条通路的多个环节。

不同治法对大鼠肝癌相关基因转录作用的研究

为探讨中医不同治法调节大鼠肝癌相关基因转录水平的差异。以DEN诱发的大鼠肝癌为模型 ,18W后将其分为模型 (B)组、西药 (C)组及中药全方 (D1)组、清热 (D2 )组、活血 (D3)组、健脾 (D4 )组 ,每组 10只 ,分别给予相应药物治疗 ,疗程 6W ,另取 10只未造模鼠为正常对照 (A)组。之后 ,处死动物 ,采用异硫氰酸胍 苯酚 氯仿一步法抽提肝组织总RNA ,DD PCR及放射自显影技术分离A组肝组织与B组肝癌组织中差异显示的基因片段 ,以此片段为探针 ,分别与各组肝组织总RNA进行Northernblot印迹杂交 ,比较其间的差异 ,同时将筛选出的阳性cDNA片段进行克隆与序列分析。结果 :从正常肝组织与模型组肝癌组织中分离出 32个差异显示的基因片段 ;Northernblot印迹杂交表明其中 9个基因片段在各组之间转录水平上存在明显差异 ;其中 ,来源于正常肝组织中的DD2 2 为新基因 ,来源于肝癌组织中的基因有 5个为已知基因 ,3个为新基因。

不同中医治法对不同肝癌细胞株的作用比较

目的 :比较不同中医治法对不同肝癌细胞株增殖的抑制作用。方法 :将不同治法的中药常规水煎醇沉后 ,采用不同浓度中药制剂直接加入培养液的给药方式 ,以MTT法测定人原发性肝癌SMMC772 1细胞株、Bel74 0 2细胞株细胞的增殖情况。结果 :①清热解毒法对两种不同人肝癌细胞株增殖的抑制作用都很明显 ,且随用药剂量的增大 ,呈量效关系 ;②活血化瘀法对SMMC772 1细胞株增殖也有较好抑制作用 ,而对Bel74 0 2细胞株增殖却作用不明显 ;③健脾理气法对SMMC772 1细胞株增殖无抑制作用 ,而对Bel74 0 2细胞株增殖却有较好作用 ;④清热解毒法与其它两治法配伍后 ,其对SMMC772 1细胞株增殖的抑制作用都不如单一清热解毒法。结论 :清热解毒法对不同肝癌细胞株增殖具有较强的抑制作用 ,支持临床大剂量使用这类中药 ,活血化瘀法与健脾理气法具有选择性的抑制作用 。

MT1E在肝癌形成过程中的表达及其在肝癌细胞中的作用

目的:探讨MT1E基因在肝癌形成过程中不同阶段的表达及其在肝癌细胞中的生物学功能.方法:DEN诱发大鼠肝癌形成模型,分别观察造模4、8、16、20wk后肝脏组织病理形态学的改变以及MT1E基因表达的差异;针对MT1E基因mRNA序列设计2个siRNA靶点,分别经质粒重组后电转入SMMC-7721肝癌细胞株中,实时荧光定量PCR检测MT1E基因的表达,MTT法检测细胞生长增殖.结果:大鼠肝癌造模4、8wk时肝组织主要表现为炎性病变,而到16wk后呈现典型的增生病变,20wk后已全部发展为肝细胞癌.MT1E基因在造模16wk后表达明显增加,与对照组比较差异显著(芯片读数:11524vs5462).成功筛选到MT1E基因RNA干扰的一个有效靶序列,电转染72h后该基因的表达量较空白对照组与阴性对照组明显降低(0.38vs1.00,0.93,P<0.01).与阴性对照组比较,有效干扰靶点电转染144h后细胞的生长增殖得到了明显抑制(0.1700±0.0313vs0.5748±0.0480,P<0.01).结论:成功应用DEN诱发大鼠肝癌形成MT1E基因在肝癌形成的后期表达明显升高其高表达与肿瘤细胞的恶性增殖有关.

PBL教学法在中医高等院校开展的现状与趋势

在简述PBL教学法源流及其利弊的基础上,综述了我国高等中医院校PBL教学的现状,对今后中医药高等教育PBL教学发展的方向进行了初步的探讨。

原发性肝癌的中医药证治研究概况

原发性肝癌（以下简称肝癌）起病隐匿，进展迅速，疗效差，生存期短，流行面广，是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一。我国医务工作者在长期防治肝癌的实践中，积累了丰富的经验，取得了可喜的成绩，及时对肝癌证治的发展给予综述研究，分析利弊，将有利于进一步深入肝...

大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆

目的克隆出大鼠肝癌高表达EST片段相关基因的cDNA完整表达序列,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。方法通过基因芯片检测出DEN诱发的大鼠肝癌高表达的EST片段;其中部分高表达的EST片段,采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出其cDNA完整表达序列。结果与正常大鼠肝组织比较,肝癌组织中明显高表达的EST片段有34个。采用EST电子克隆技术与PCR技术相结合的方法,成功克隆出4个EST片段的cDNA序列,经进一步BLAST对比分析,证明G15、G20、G36、G40等4个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480746、DQ480747、DQ480744、DQ912022。结论利用大鼠基因芯片高通量地筛选出DEN诱发的肝癌组织高表达的有关基因,并在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出4个新基因的cDNA序列,为今后进一步深入观察这些基因的功能及其在肝癌发生、发展过程中的作用机制打下良好的研究基础。

抑癌方与喃氟啶对DEN所致大鼠肝癌抑制作用的比较

目的和方法:使用DEN诱发大鼠肝癌,分别观察抑癌方、喃氟啶(FT-207)对肝脏的病理及其N-ras、H-ras、P^(53)等基因转录水平的作用。结果:中药与FT-207对DEN所致大鼠肝癌均有一定的抑制作用;对肝脏的某些基因的转录水平有一定的调控作用。结论:中药抑癌方作用优于FT-207。

中医证候与基因相关性研究的现状与反思

从疾病相关基因的多态性、疾病相关基因表达的改变与中医证候的关系和证候与后基因组学的关系等三个方面,综述了国内中医证候与基因相关性研究的现状。提出中医证候的微观研究应当结合中医证候的客观化、标准化研究;研究中应注意“同病异治”、“异病同治”的结合,检测目标组织的合理选择,检测技术的选择和优化,以及排除盲从,注重锐意创新等。

克隆与健脾益气法有关的大鼠肝癌新基因

目的:克隆健脾益气法明显下调基因中EST片段cDNA的完整表达序列.方法:从689个健脾益气法明显下调的基因中,采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出有关EST片段的cDNA完整表达序列.结果:成功筛选出11个EST片段的cDNA序列(G2、G4、G5、G6、G11、G14、G15、G16、G17、G18、G20).经进一步BLAST对比分析,证明G14、G15、G203个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480745、DQ480746、DQ480747.结论:本研究成功克隆出3个中医健脾益气法能明显调控的新基因cDNA序列.这为今后进一步深入观察这些基因的功能以及探讨不同中医治法的作用机制提供了良好的研究基础.

MT1E在肝癌细胞中的作用及不同中医治法对其表达调控的差异研究

目的:比较常用不同中医治法对MT1E表达调控作用的差异,以及初步探讨MT1E在肝癌细胞中的生物学功能。方法:(1)以DEN诱发大鼠肝癌形成为模型,应用基因芯片检测健脾益气、清热解毒、活血化瘀等常用中医治法对MT1E基因表达的差异;(2)针对MT1E基因mRNA序列设计2个siRNA靶点,分别经质粒重组后电转入SMMC-7721肝癌细胞株中,用实时荧光定量PCR技术检测MT1E基因的表达情况,用MTT法检测细胞生长增殖情况。结果:(1)芯片结果显示,MT1E基因在肝癌形成后表达明显增加,不同中医治法对其具有不同程度的调控作用,其中健脾益气法的下调作用最明显;(2)成功筛选到MT1E基因RNA干扰的1个有效靶序列,经实时荧光定量PCR技术检测到电转染72h后,该基因的表达水平明显降低;(3)MTT的结果显示,有效干扰靶点电转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制。讨论:MT1E基因是中医健脾益气法防治原发性肝癌的有效靶点之一,经生物学功能研究表明,该基因的高表达与肿瘤细胞的恶性增殖有关。

健脾理气法防治肝癌的研究进展

综述了近年健脾理气法在防治肝癌中临床应用情况,如相关药物出现频率、运用规律、疗效情况等,认为脾虚气滞是肝癌的常见基本证,健脾理气法是临床防治肝癌的常用治法;从相关实验研究来论述该法对免疫系统、预防肝癌发生及转移、复发等方面的作用。建议肝癌临床研究及疗效评价体系应不断客观化与标准化,对健脾理气中药机理研究应多方位、多靶点深入开展。

EBNA1BP2基因在肝癌形成过程中的表达及不同中医治法的调控作用

目的:探讨EBNA1BP2基因在肝癌形成过程中不同阶段的表达情况及不同中医治法对其在肝癌中表达的影响。方法:①以DEN诱发大鼠肝癌模型,分别观察造模4、8、16、20周后其肝脏组织病理形态学的改变以及EB-NA1BP2基因表达的差异。②应用基因芯片检测健脾益气、清热解毒、活血化瘀等常用中医治法对大鼠EBNA1BP2基因表达的影响。结果:①肝组织病理形态学观察结果表明,大鼠肝癌造模4、8周时肝组织主要表现为炎性病变,而到16周后呈现典型的增生病变,20周后已全部发展为肝细胞癌。②芯片结果显示,EBNA1BP2基因在DEN诱发大鼠肝癌形成过程中的表达量持续增加,至16周后形成表达高峰。③不同中医治法对EBNA1BP2基因在大鼠肝癌中具有不同程度的调控作用,其中健脾益气法下调作用较明显。结论:成功应用DEN诱发大鼠肝癌模型,EBNA1BP2基因在肝癌形成过程中表达持续增加,健脾益气法对其具有明显的下调作用。

清热、活血、健脾等不同中医治法对癌基因ras转录调节的实验研究

目的 :研究原发性肝癌中清热解毒、活血化瘀、健脾理气等常用不同中医治法对大鼠肝癌的作用机理及其差异。方法 :采用二乙基亚硝胺 (DEN)水溶液诱发大鼠肝癌模型 ,分别观察这些不同治法对肝癌大鼠肝组织AFP及三个Ras基因的转录调节作用。结果 :(1)不同治法能够针对性地调节癌基因Ras的转录水平 ,其中清热解毒法和活血化瘀法对N ras基因、健脾理气法对H ras和K ras基因的转录水平都有显著的下调作用 ;(2 )不同治法对大鼠肝组织AFP基因转录有不同程度的下调作用 ,其中 ,清热解毒法作用最强。结论 :不同中医治法能够不同程度地调节肝癌发生发展过程中一些重要癌基因的转录 ,并且这些治法有着明显的作用选择性 ,其中清热解毒法、活血化瘀法对肿瘤的直接抑制作用较好 。

2060例原发性肝癌患者证候特点分析

目的:观察肝癌患者证的演变及兼证特点。方法:采用大样本临床流行病学调研方案,临床调查原发性肝癌2060例。结果:原发性肝癌的病机是随病程的发展不断变化的,Ⅰ～Ⅲ期证候以肝郁气滞、脾气虚为主,Ⅱ期以肝血瘀阻、气滞、气虚、湿热等为主,Ⅲ期以气虚、阴虚、血瘀、气滞、水湿内停等为主。各期中证型出现率居前4位的是气滞、血瘀、气虚、阴虚。还显示,肝癌无证可辨者仅占1.07％,而3个证型组合者占23.06％,4个证型组合者占24.37％,5个证型组合者占18.11％,平均每个患者出现3.75个证型。其中Ⅰ期平均2.03证次,Ⅱ期平均3.47证次,Ⅲ期平均4.99证次。结论:随着病程的发展,证的相兼愈加显著,病机愈加复杂,而气滞血瘀与气阴两虚是根本病机,贯穿于该病的始终。

大鼠和小鼠辨证论治标准的建立和用途

大鼠和小鼠辨证论治方法和标准是具有中医药行业特色的方法和标准,其建立有助于满足中医药辨证论治研发的需要。本文介绍了建立大鼠和小鼠辨证论治标准所开展的系列研发工作,发现:(1)大鼠和小鼠可以用于模拟中医临床的诊法和辨证,可以采集到大量的四诊信息,满足辨证论治的需要;(2)利用大鼠和小鼠可以实现诊法和辨证的标准化、计量化,所建立的方法便于实验操作与普及;(3)正常大鼠和小鼠存在体质和证候的差异,常见疾病大鼠和小鼠会自发形成证候,发生证候的兼夹和演变,与人类近似;(4)证候存在复杂的物质基础,涉及神经内分泌免疫网络各组织基因表达与剪接的差异;(5)利用大鼠和小鼠可以开展个体化辨证论治及计量化疗效比较与评价。该方法和标准的主要用途包括:(1)证候模型动物的证候属性鉴定;(2)中医基础学科的研究,如藏象理论、证候的物质基础、辩证论治方法和作用机制、中医诊断学等研究;(3)中医临床学科的研究,如辨证论治疗效的比较与评价、辨证论治方案的优化、防治未病的研究;(4)中药学科的研究,如中药药性的研究、中药和方剂的药理研究等。

二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达上调的基因

目的:首次大范围地观察二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌组织基因表达的差异,探索DEN诱发肝癌的分子机制.方法:DEN诱导大鼠肝癌,常规抽提和纯化RNA,采用AffymetrixRat230AGeneChip及技术比较肝癌组织与正常大鼠肝组织基因表达的差异.结果:在芯片的15710个基因中,肝癌有84.54%的基因阳性表达,肝癌基因表达在正常肝脏5倍以上的有509个,其中325个为EST片段,已知基因184个,其中的168个基因可以检索到有关文献的报道.在这168个基因中,有100个基因被发现与肿瘤有关,其中有36个与肝癌有关;有4个基因与肝脏有关;另有64个基因与肿瘤和肝脏无关.结论:?DEN诱发大鼠肝癌的后基因组变化中168个基因值得优先关注.