微小隐孢子虫转录共激活因子CpADA2的生物信息学分析及其编码基因的真核表达

本研究旨在对微小隐孢子虫转录共激活因子ADA2的结构和功能进行生物信息学分析,对其编码基因CpADA2进行真核表达。利用在线生物信息学软件对CpADA2进行生物信息学分析,结果显示,CpADA2含有ZnF和SANT结构域,全长673个氨基酸残基,分子质量为76 kDa,属于可溶性蛋白;不含跨膜区和信号肽,但存在多样化的激酶特异性磷酸化位点;二级结构由α螺旋(36.70%)、β折叠(11.74%)和无规卷曲(51.56%)构成;三级结构中SANT结构域呈典型的α螺旋串联重复构象;互作网络模型和功能预测表明,该蛋白具有锌离子结合特性,并可能参与组蛋白乙酰化过程。以微小隐孢子虫cDNA为模板,PCR扩增得到CpADA2基因,成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-CMV14-CpADA2,转染至293T细胞后,Western blot分析显示,转染重组质粒的细胞成功表达重组CpADA2蛋白。本研究为后续开展CpADA2的功能研究提供了基础。

不同品种警犬肠道菌群的比较研究

本研究通过对比分析拉布拉多巡回犬(Labrador Retriever)和比利时马里努阿犬(Belgian Malinois)的肠道菌群,旨在探寻与警犬的生长发育和工作性能相关的关键性微生物物种。采用高通量测序技术对两种警犬的肠道菌群的16S rRNA基因进行测序,然后利用生物信息学分析技术对比研究两个品种警犬肠道的微生物群落结构。通过对测序数据进行降噪分析,总共获得了1819499条高质量的有效序列,平均测序长度为411 bp。然后通过97%的序列相似性进行操作分类单元(OUT)聚类,总共获得了包括17个门,25个纲,67个目,122个科和122个属的细菌。首先进行Alpha多样性分析,发现拉布拉多巡回犬的肠道菌群的丰度和多样性都明显高于比利时马里努阿犬,然后再通过主坐标分析(PCoA)方法进行Beta多样性分析,发现拉布拉多巡回犬和比利时马里努阿犬的肠道菌群分别形成了不同的分类簇。物种组成分析结果表明,警犬的肠道微生物在门分类水平主要是由厚壁菌门(Firmicutes,平均占比24.33%)、梭杆菌门(Fusobacteroidetes,平均占比23.45%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,平均占比23.29%)、变形菌门(Proteobacteria,平均占比16.06%)、放线菌门(Actinobacteria,平均占比6.65%)和弯曲杆菌门(Actinobacteria,平均占比5.19%)组成;在属分类水平则是主要由梭杆菌属(Fusobacterium,平均占比22.56%),普氏菌属(Prevotella,平均占比12.79%)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum,平均占比9.23%)、巨单胞菌属(Megamonas,平均占比7.25%)和棒状杆菌属(Corynebacterium,平均占比4.88%)等组成。本研究通过高通量测序技术对比分析了两个品种警犬的肠道菌群的结构特征和物种组成,可以为开发宠物益生菌等相关产品提供研究思路和数据支持。

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的克隆及核苷酸序列分析

目的对编码微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)子孢子表面抗原CP15基因进行克隆和序列分析,并对其编码的氨基酸变异情况进行分析。方法对田间分离的鼠、兔、猪源微小隐孢子虫提取总RNA,经RT-PCR扩增CP15基因,克隆到pMD 18-T载体中,鉴定正确后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行同源性比对。结果克隆的CP15基因核苷酸序列与GenBank登录的核苷酸序列比较,鼠源微小隐孢子虫同源性为99.23%,兔源微小隐孢子虫为97.96%,猪源微小隐孢子虫为98.72%,氨基酸序列同源性分别为100%、97.7%和98.4%。结论获得微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因,不同宿主来源的CP15基因序列高度一致,为利用该基因进行免疫预防和诊断研究奠定了基础。

微小隐孢子虫感染绵羊模型的建立

为建立稳定、可靠的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染绵羊模型,将4只2日龄绵羊分成2组,分别经口接种1×106个(低剂量组)和1×107个(高剂量组)的C.parvum卵囊,观察绵羊每日精神状况,并采集粪便样品,提取DNA,用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法进行检测,计算每日排卵囊数量。结果表明,两组羔羊均从第4天开始出现精神沉郁、食欲下降及严重的腹泻症状,镜检发现有大量的C.parvum卵囊排出,其中高剂量组的2只羔羊在感染后的第10天死亡。TaqMan实时荧光定量PCR检测结果显示,两组羔羊均从第1天开始有少量的卵囊排出,从第5天开始增多。其中低剂量组的1#羔羊第9天达到高峰,2#羔羊第7天达到高峰,随后排卵囊量开始下降,2只羔羊直到实验结束的第36天仍有卵囊排出,并且首次发现羔羊感染C.parvum后出现3个排卵囊高峰期。高剂量组的2只羔羊均在第6天达到高峰,其中3#羔羊第7天仍然有大量卵囊排出,4#羔羊第7天和第8天仍有大量卵囊排出,随后开始下降;高剂量组羔羊高峰期排卵囊数量明显高于低剂量组羔羊高峰期排卵囊数量。对死亡羔羊进行的肠道组织学观察,发现虫体寄生部位肠黏膜层出现大面积实质细胞脱落,局部可见肠腺数量减少,被增生的结缔组织取代。提取死亡羔羊肠道内容物和粪便DNA,进行套式PCR扩增,经测序鉴定,证实为C.parvum感染,与羔羊接种的虫种一致。上述结果表明,接种1×106个C.parvum卵囊,绵羊出现明显的临床症状,并伴有大量的卵囊排出,可以作为C.parvum的感染模型;而接种1×107个C.parvum卵囊,绵羊会发生死亡,但是能够排出更多的卵囊,适合进行隐孢子虫的繁殖试验。为进一步利用该模型研究C.parvum的致病机理、疫苗和药物筛选奠定了良好的基础。

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达

提取微小隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA,用RT-PCR扩增微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因并克隆到pMD18-T载体中。将鉴定正确的序列亚克隆于原核表达载体pET-28b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫动物后检测血清抗体。结果显示,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录的序列的同源性为98.66%。目的基因在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。表达的重组蛋白占菌体可溶性总蛋白的57.5%,纯化的重组蛋白纯度达95.2%。重组蛋白可被兔抗微小隐孢子虫血清特异性识别,用重组蛋白免疫3次后,兔血清特异性抗体达到较高水平。表明,该重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。

隐孢子虫三种实时荧光定量PCR检测方法的比较

为筛选一种检测谱广、敏感性好、特异性高的隐孢子虫实时荧光定量PCR法,对JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法三种隐孢子虫实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了检测,并与基于18S r DNA序列的套式PCR方法进行了比较。结果显示,以10倍倍比稀释的含有微小隐孢子虫18S r DNA基因片段的重组质粒为模板,成功地建立了三种实时荧光定量PCR方法;敏感性试验显示,JVAP18S法和Csp18S法最低可检测0.1个卵囊,而CRU18S法最低只能检测到1个卵囊,但他们均比套式PCR方法敏感;特异性试验结果显示,三种实时荧光定量PCR法均可检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)和贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),而其他属寄生虫和细菌DNA的检测结果均为阴性;重复性试验结果显示,JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批内变异系数分别为0.69%~2.68%、0.11%~4.93%、0.04%~2.89%,批间变异系数分别为0.52%~5.75%、2.09%~5.13%、1.15%~3.71%;对50份小鼠田间粪便样品检测结果显示,JVAP18S法检测的阳性率为84.00%,显著高于套式PCR法检测的64.00%的阳性率。上述结果表明,三种实时荧光定量PCR法均能有效检测隐孢子虫,比较而言,JVAP18S法敏感性高、特异性强、重复性好,尤其适合于隐孢子虫含量较少的样品检测。

顶复门原虫棒状体蛋白ROP18的研究进展

顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子。其中ROP18是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的ROP2家族蛋白成员之一,在刚地弓形虫入侵宿主细胞阶段发挥重要作用,是纳虫空泡(PV)形成时宿主细胞免疫的抑制因子。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。本文以目前研究最多的刚地弓形虫ROP18为主,对其发现历史、结构、分泌及定位、对宿主的毒力机制及应用现状做一综述。

鸡六种艾美耳球虫ITS-1的克隆和序列分析

为对上海地区分离的6种鸡艾美耳球虫内转录间隔区1(ITS-1)进行克隆和序列分析,探索ITS-1区域序列在鸡球虫分类学中的作用,利用一对属特异性引物,对上海地区分离的6种球虫的ITS-1序列进行PCR扩增,扩增产物克隆到pMD18-T后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行系统进化树分析。结果显示,巨型艾美耳球虫有大小分别为547bp和422bp两条PCR扩增条带;和缓艾美耳球虫有大小为627bp和493bp两条PCR扩增条带;其他4种球虫均为一条PCR扩增条带,大小分别为柔嫩艾美耳球虫668bp,毒害艾美耳球虫691bp,堆型艾美耳球虫507bp,早熟艾美耳球虫541bp。6种球虫序列之间的同源性为34%～52%。系统进化分析显示,各个种分别与GenBank中下载的对应球虫种在同一分支上。

典型城市屠宰及销售猪肉中弓形虫的分子检测研究

为了解我国重庆市、广州市和上海市3个典型城市屠宰环节和销售环节猪肉中弓形虫的携带情况,在这3个城市共采集猪膈肌样品393份,分别进行胃蛋白酶消化并提取基因组DNA,以弓形虫529 bp重复序列为目的基因,进行PCR扩增。结果显示,3个城市猪膈肌肉中弓形虫的阳性率为5.34%,其中重庆市的阳性率最高,达9.83%;其次是上海市,为3.17%;而广州市则未检出阳性样品。夏季和秋季间、屠宰环节和销售环节间的阳性率差异均不具备显著统计学意义。本研究结果为减少弓形虫对上述地区人群的危害,预防和控制弓形虫病流行,指导猪群的饲养管理以及提高畜牧业经济效益提供了有益指导。

微小隐孢子虫三个基因主要抗原表位区的串联表达及其抗原性分析

应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞表位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm。将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列。Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础。

不同DNA提取方法对隐孢子虫卵囊PCR检测的影响

为了提高隐孢子虫PCR检测的敏感性和效率,采用10种基因组DNA提取方法,对隐孢子虫卵囊DNA进行提取,对提取的DNA进行nested PCR扩增。经过3次重复试验,结果显示,Chelex 100法、FTA试纸法和Wizard DNAClean-Up System试剂盒法敏感性最高,能够稳定地扩增出1×102个卵囊提取的DNA,适合隐孢子虫病分子流行病学调查时大量样品DNA的提取。

隐孢子虫鼠基因型卵囊壁蛋白CP41基因的原核表达及抗血清的制备

为克隆和表达编码隐孢子虫鼠基因型卵囊壁蛋白CP41基因,以隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA作为模板,RT-PCR扩增CP41基因,克隆到pMD18-T载体并进行序列测定,构建重组质粒pGEX-5x-3-CP41,转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导,表达产物SDS-PAGE检测目的蛋白,westernblot分析该重组蛋白的免疫活性。结果显示,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录中的序列比较,同源性为90.5%,氨基酸序列同源性为87.57%。重组质粒转化菌在IPTG诱导下以包涵体形式高效表达,表达的融合蛋白大小约为46ku,westernblot分析显示,纯化复性后的重组蛋白可被辣根过氧化物酶标记的抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)单克隆抗体、隐孢子虫兔基因型感染兔血清特异性识别。ELISA检测结果表明,该蛋白3次免疫无特征病原体新西兰白兔后,兔血清特异性抗体达到较高水平,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。

隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较

为克隆隐孢子虫不同基因型子孢子表面抗原P23基因,比较其序列差异,提取上海地区分离的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)、隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit geno-type)、隐孢子虫猪基因型Ⅱ(Cryptosporidiumpig genotypeⅡ)总RNA,经RT-PCR扩增P23基因,克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,并与GenBank上下载的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)序列进行同源性比对。结果显示,从隐孢子虫3个基因型中均扩增出了P23基因。与微小隐孢子虫P23基因核苷酸序列比较,隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型ⅡP23基因同源性分别为97.6%、97.3%、97.3%,氨基酸序列同源性分别为97.3%、97.3%和96.4%。获得了隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ子孢子表面抗原P23基因。

犬隐孢子虫病研究进展

犬隐孢子虫(C.canis)广泛寄生于犬体内,也可感染人,引起犬和人的隐孢子虫病(Cryptospo-ridiosis)。近年来,随着其生物学特性及流行病学研究的深入,犬隐孢子虫逐渐引起了人们的重视。论文从病原学、寄生部位与致病性、流行病学、诊断和防治等方面阐述了犬隐孢子虫病的研究现状,为有效防治该病提供参考。

猪附红细胞体MSG1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体MSG1基因的遗传变异特点,从上海地区3个屠宰场采集自然感染附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA,根据GenBank已经发表的猪附红细胞体MSG1基因序列(登录号AM407404.1),设计引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果共获得了82条猪附红细胞体MSG1基因序列,序列长度为1 011bp,共编码336个氨基酸。同源性分析显示与GenBank中已经发表的猪附红细胞体MSG1基因核苷酸序列相似性为96.5%～98.3%,氨基酸的相似性为97.9%～99.1%。MSG1基因核苷酸序列的系统进化分析表明,上海地区猪附红细胞体分离株与GenBank登录的德国54/96分离株序列的亲缘关系较远。

基于微小隐孢子虫重组CP15/60蛋白的间接ELISA检测方法的建立及上海市猪隐孢子虫感染情况调查

为建立敏感、特异的猪隐孢子虫感染血清学检测方法,了解上海市猪隐孢子虫感染情况,以纯化的重组CP15/60(r CP15/60)为诊断抗原,建立了检测隐孢子虫感染的间接ELISA方法,并对上海市猪隐孢子虫感染情况进行血清学调查。结果显示,与Nested PCR方法检测结果相比,本研究建立的r CP15/60-ELISA方法的阴阳性符合率为83.3%,敏感性为100%,特异性为80%;重复性试验的变异系数在12.5%之内;对341份猪田间血清进行检测,阳性为194份,占56.89%,表明该方法可用于实验室初步诊断和现场猪隐孢子虫病的流行病学调查。

布鲁菌半胱氨酸水解酶在甲硫氨酸循环中的催化活性研究

[目的]细菌的sah H基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sah H),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒p ET28a-Bru-sah H和p ET28a-Pse-sah H,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株的Sah H重组蛋白Bru-Sah H和Pse-Sah H。将纯化后的Bru-Sah H、Pse-Sah H以及我们前期表达纯化的禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的Pfs和Lux S蛋白,分别在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),通过对产物同型半胱氨酸(HCY)的浓度测定,评价不同重组蛋白的催化活性,并对催化底物时产生的自诱导分子2(AI-2)活性进行检测。[结果]Bru-Sah H和Pse-Sah H分别催化1 mmol·L-1SAH生成38和47μmol·L-1HCY,而APEC的Pfs和Lux S蛋白能催化相同浓度的SAH产生401μmol·L-1HCY。运用哈维弧菌BB170检测上述底物的AI-2活性,结果表明只有同时采用AEPC的Pfs和Lux S蛋白催化SAH,才能形成有活性的AI-2分子,而Bru-Sah H和Pce-Sah H均不能催化SAH形成活性AI-2分子。[结论]Bru-Sah H能催化SAH生成HCY,为进一步研究sah H在布鲁菌感染过程中的作用提供依据。

鸡球虫抗药性相关差异基因和蛋白研究进展

抗药性是药物防治鸡球虫病的主要障碍之一。目前,鸡球虫的抗药性机制尚不清楚。论文对国内外学者分别采用的随机引物扩增多态性DNA、mRNA差异显示、抑制性消减杂交、cDNA阵列等技术研究抗药性相关差异基因,以及采用同工酶、ATP酶活性检测、聚苯烯酰胺电泳、蛋白质双向电泳结合质谱分析等技术研究抗药性相关差异表达蛋白的研究情况进行了综述,对鸡球虫抗药性相关差异基因和蛋白差异表达研究进行了展望。

猪源附红细胞体rnpB基因的克隆与序列比较

为了解猪源附红细胞体（Mycoplasma spp.）RNA酶P RNA（RNase P RNA,rnpB）基因序列变异状况,将实验室保存的经16S rRNA基因序列分析鉴定的53份猪源附红细胞体阳性DNA样品用于rnpB基因的扩增,扩增产物克隆至pMD18-T载体并进行序列测定。将获得的序列与GenBank登录的猪附红细胞体（Mycoplasma suis）德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）进行分析和比对,利用MEGA5.0软件构建系统发育树,并与16S rRNA判定结果进行比较。结果共得到42条猪附红细胞体rnpB基因和11条小附红细胞体（M.parvum）rnpB基因序列。猪附红细胞体上海分离株rnpB基因与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因之间的核苷酸序列相似性为98.1%～100.0%;小附红细胞体上海分离株rnpB基因与猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列的相似性为91.0%,与猪附红细胞体上海分离株rnpB基因序列相似性为90.0%～91.0%。系统进化分析显示猪附红细胞体rnpB基因与小附红细胞体rnpB基因分布在不同聚簇上,与16S rRNA基因序列鉴定结果一致。